Konstruksi Vektor Dan Ekspresi Protein Human Egfrviii Domain Ekstraseluler Pada Escherichia Coli

Abstract

Reseptor faktor pertumbuhan epidermal varian III (EGFRvIII) adalah mutasi dari EGFR yang mengalami delesi pada bagian ekstraseluler dari ekson 2 sampai ekson 7. Reseptor ini berperan penting dalam pertumbuhan dan proliferasi sel kanker. Bagian dari ujung-N merupakan bagian unik karena memiliki epitop unik yang berbeda dari bentuk EGFR normal dan dapat dikenali dengan antibodi spesifik anti-EGFRvIII. Fragmen antibodi untai tunggal (scFv) merupakan antibodi anti-EGFRvIII yang memiliki aktifitas spesifik yang mampu mengenali epitop EGFRvIII tersebut. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengekspresikan bagian ekstraseluler dari protein reseptor ini pada Escherichia coli, mempelajarinya lebih jauh dan menganalisis interaksi antigen EGFRvIII dengan antibodi anti-EGFRvIII dengan bantuan manik magnet. Pada sistem ekspresi di E. coli biasanya menghadapi beberapa kendala, yaitu tingkat ekspresi yang rendah, kebocoran ekspresi, pembentukan badan inklusi, dan protein yang terpotong. Salah satu cara untuk mengatasi masalah tersebut adalah dengan mensekresikan protein rekombinan tersebut menuju bagian periplasma. Selain itu, periplasma E. coli telah dilaporkan dapat menjaga fungsionalitas dan stabilitas protein lebih efisien dibandingkan sitoplasma. Oleh karena itu, dalam penelitian ini telah dikonstruksi sebuah vektor pJ404 rekombinan yang mengandung sekuen gen EGFRvIII domain ekstraseluler dan sebuah peptida sinyal yang berasal dari Bacillus xylanase (xylB-sp) yang difusikan pada bagian ujung-N. Gen penanda lainnya sebuah protein fluoresen biru (bfp, mTurqoise) yang telah disubklon pada bagian ujung-C berfungsi untuk menandai ekspresi protein EGFRvIII rekombinan pada periplasma E. coli. Vektor rekombinan ditransformasikan ke dalam E. coli BL21(DE3) untuk analisis ekspresi protein dan dipurifikasi. Hasil dari penelitian ini menunjukkan bahwa fusi gen dari EGFRvIII::bfp telah berhasil diklon dan vektor rekombinan pJ404-EGFRvIII-bfp telah berhasil dikonstruksi. Selanjutnya, protein yang mengandung fusi EGFRvIII-bfp telah berhasil diekspresikan pada periplasma E. coli. Hal tersebut ditunjukkan dengan terdeteksinya protein berukuran sekitar 32 kDa, ukuran protein yang diprediksi dari fusi protein tersebut yang ditunjukkan dari hasil analisis SDS-PAGE dan Western Blot. Pengamatan di bawah mikroskop fluoresen menunjukkan sebuah pendaran cahaya berwarna biru yang dihasilkan dari E. coli transforman yang diinduksi. Eksperimen dengan menggunakan manik magnet yang diselimuti dengan protein antigen EGFRvIII rekombinan menunjukkan bahwa sel transforman Pichia pastoris yang terdapat antibodi scFv anti-EGFRvIII pada permukaan sel dapat melekat pada permukaan manik magnet. Hal tersebut membuktikan bahwa terjadi interaksi antara antigen (pada permukaan manik magnet) dengan antibodi (pada permukaan sel). Hal ini menunjukkan bahwa fusi protein antigen EGFRvIII ini memiliki struktur yang fungsional sehingga dapat dikenali dengan baik oleh antibodi spesifiknya.