Rekayasa Genetik Nicotiana Tabacum Sr1 Dengan Gen Glutathione S-Transferase 12 (Gst12)

Abstract

Glutathione S-transferase (GST) merupakan enzim antioksidan yang berperan dalam pertahanan tanaman terhadap cekaman biotik dan abiotik. Gen GST12 adalah salah satu anggota dari gen GST. Gen GST12 terlibat dalam pertahanan tanaman terhadap cekaman aluminium dan pH rendah. cDNA gen GST12 dari kedelai kultivar Slamet telah berhasil diisolasi dengan ukuran 722 pb. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mendapatkan vektor ekspresi gen glutathione S-transferase 12 (GST12) dan tanaman Nicotiana tabacum SR1 transgenik. Vektor ekspresi gen GST12 telah berhasil dikonstruksi menggunakan metode gateway cloning. cDNA GST12 telah berhasil diisolasi dari plasmid pGEM-GST12. Hasil isolasi cDNA GST12 telah berhasil disisipkan ke dalam vektor pENTRTM/D-TOPO® menggunakan teknik directional TOPO cloning. Vektor rekombinan pENTR-GST12 telah berhasil direkombinasikan dengan vektor ekspresi pGWB502 sehingga gen GST12 tersisip ke dalam vektor ekspresi pGWB502 menjadi vektor ekspresi rekombinan pGWB502-GST12. Verifikasi vektor ekspresi rekombinan pGWB502-GST12 dengan PCR menggunakan primer GST12-F dan NosT-R, serta pemotongan dengan enzim restriksi HindIII dan EcoR1 mengkonfirmasi bahwa plasmid pGWB502-GST12 yang dihasilkan telah mengandung gen GST12. Vektor ekspresi rekombinan pGWB502-GST12 di dalam bakteri E. coli DH5α telah berhasil diintroduksikan ke dalam bakteri A. tumefaciens LBA4404 menggunakan metode triparental mating. A. tumefaciens LBA4404 yang mengandung pGWB502-GST12 telah dikonfirmasi dengan PCR koloni menggunakan primer GST12-F dan NosT-R. Transformasi genetik tanaman Nicotiana tabacum SR1 melalui perantara A. tumefaciens LBA4404 rekombinan yang dilakukan dengan metode ko-kultivasi menggunakan potongan daun sebagai eksplan telah menghasilkan beberapa tanaman Nicotiana tabacum SR1 transgenik. Analisis molekuler dengan PCR menggunakan primer hpt-F and hpt-R telah mengkonfirmasi bahwa tanaman Nicotiana tabacum SR1 transgenik mengandung gen hpt. Gen hpt terpaut dekat dengan gen GST12. Oleh karena itu, tanaman Nicotiana tabacum SR1 transgenik yang mengandung gen hpt juga mengandung gen GST12. Analisis PCR menunjukkan bahwa gen GST12 yang terintegrasi di dalam genom tanaman Nicotiana tabacum SR1 transgenik mengalami delesi.