Keanekaragaman Cendawan Endofit yang dapat Dikulturkan asal Cinchona calisaya Wedd.: Filogeni Molekular dan Profil Alkaloidnya.

Abstract

Pohon kina (Cinchona spp.) dikenal sebagai tanaman obat anti-malaria karena mengandung metabolit alkaloid yang disebut kuinina. Saat ini produksi kuinina di Indonesia jumlahnya terbatas dan tidak mencukupi kebutuhan industri disebabkan karena berkurangnya area perkebunan kina. Oleh karena itu, sumber alternatif produksi kuinina sangat diperlukan. Cendawan endofit diketahui memiliki potensi untuk memproduksi senyawa metabolit yang mirip atau sama dengan senyawa yang diproduksi oleh inangnya. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk mengeksplorasi diversitas cendawan endofit dari Cinchona calisaya dan potensinya dalam memproduksi alkaloid sinkona seperti kuinina, kuinidina, sinkonina, dan sinkonidina. Analisis struktur komunitas cendawan endofit yang hidup di berbagai organ kina yang berbeda juga dilakukan. Cendawan endofit diisolasi dari ranting, daun, akar, kulit kayu, buah, dan bunga yang sehat. Sampel dikoleksi dari 5 pohon kina C. calisaya yang tumbuh di perkebunan kina milik Pusat Penelitian dan Perkebunan Teh dan Kina, Gambung, Ciwidey, Jawa Barat. Identifikasi isolat cendawan endofit melibatkan kombinasi analisis molekular filogenetik berdasarkan daerah ITS rDNA dan karakteristik morfologi. Analisis filogenetik multigen dilakukan untuk mengidentifikasi isolat-isolat dominan. Deteksi produksi alkaloid sinkona oleh cendawan endofit ditentukan melalui analisis HPLC. Sebanyak 687 strain cendawan endofit diisolasi dan dikelompokkan menjadi 96 morfotipe. Seluruh strain terbagi ke dalam 3 kelas, 11 famili, 18 genus, dan 37 spesies dari Ascomycota. Kelas terbesar adalah Sodariomycetes (5 famili: Nectriaceae, Melanconiaceae, Hypocreaceae, Chaetosphaeriaceae, Diaporthaceae), diikuti oleh Dothidiomycetes (5 famili: Didymellaceae, Leptosphariaceae, Botryosphaeriaceae, Davidiellaceae, Mycosphaerellaceae), dan Eurotiomycetes (1 famili: Trichocomaceae). Spesies yang teridentifikasi dari C. calisaya adalah Aspegillus sydowii, A. versicolor, Cladosporium oxysporum, Colletotrichum acutatum, Col. aenigma, Col. arxii, Col. boninense, Col. brasiliense, Col. crassipes, Col. gloeosporioides, Diaporthe beckhausii, D. endophytica, D. eucalyptorum, D. ganjae, D. helianthi, D. hongkongensis, D. infecunda, D. litchicola, D. phaseolorum, D. pseudomangiferae, D. psoraleae-pinnatae, Fusarium incarnatum, F. oxysporum, F. solani, Gliocladiopsis tenuis, Ilyonectria anthuricola, Leptosphaerina chartarum, Neofusicoccum parvum, Penicillium citrinum, Pestalotiopsis adusta, Phomopsis palmicola, Pho. tersa, Phyllosticta capitalensis, Pyrigemmula aurantiaca, Peyronellaea coffeae-arabicae, Trichoderma hamatum, and T. atroviridae. Beberapa spesies adalah catatan baru cendawan endofit yang berasal dari pohon kina. Analisis filogenetik cendawan endofit dari organ yang berbeda menunjukkan bahwa beberapa genus memiliki lebih dari satu spesies yang berasosiasi dengan C. calisaya, dan beberapa diantaranya bersifat organ spesifik. Sebagai contoh D. endophytica di daun, D. eucalyptorum di kulit kayu, D. ganjae di ranting, D. phaseolorum di buah, dan D. psoraleae-pinnatae di petiol. Data ini memberikan informasi bahwa cendawan memiliki kemampuan beradaptasi dengan mikrohabitat yang berbeda.. Analisis struktur komunitas menunjukkan bahwa ranting dikolonisasi lebih banyak jenis cendawan. Indeks diversitas Shannon-Wiener menunjukkan daun dan buah merupakan organ yang paling beragam spesies cendawan endofitiknya. Diaporthe spp. dominan hampir di seluruh organ kecuali bunga, dan banyak ditemukan di ranting. Komunitas cendawan endofit pada organ yang berada di atas tanah lebih melimpah dan lebih beragam daripada komunitas di bawah tanah. Komunitas cendawan endofitik pada akar sangat berbeda dari komunitas cendawan endofit pada organ lainnya yang berada di atas tanah. Hasil temuan ini memberikan kontribusi pada pengayaan informasi tentang keanekaragaman, distribusi, dan dominasi spesies dari cendawan endofit pada tanaman obat, khususnya C. calisaya. Hasil analisis HPLC menunjukkan bahwa sekitar 44 taxa terdeteksi memproduksi kuinina, terdiri dari:. Aspergillus (2 morfotipe), Cladosporium, Colletotrichum (3 morfotipe), Cercospora, Diaporthe (24 morfotipe), Fusarium (5 morfotipe), Leptosphaerulina (2 morfotipe), Neofusicoccum, Penicillium, Pestalotiopsis, Phomopsis, Phyllosticta, dan Trichoderma. Analisis kuantitatif menunjukkan bahwa Diaporthe sp. M13 and M70, dan D. litchicola M21 memproduksi kuinina dengan konsentrasi paling tinggi. Selain itu, enam morfotipe Diaporthe (D. endophytica InaCC-F237, Diaporthe sp. InaCC-F235, InaCC-F236, InaCC-F238, InaCC-F239, InaCC-F2310) mampu memproduksi kuinina, sinkonina dan sinkonidina. Dua morfotipe Cercospora (M18a, M18b) dan 5 strain Fusarium (F. incarnatum M34, M66, M67; F. oxysporum M16; F. solani M93, M97) mampu memproduksi kuinina dan sinkonina. Taksa pada studi ini merupakan catatan baru untuk cendawan yang mampu memproduksi kuinina, sinkonina, dan sinkonidina. Hal ini menunjukkan bahwa cendawan endofit dapat dijadikan sumber produksi alternatif untuk kuinina, kuinidina, sinkonina, dan sinkonidina. Determinasi kandidat taksa baru dengan menggunakan pendekatan multi-gen berdasarkan sekuen daerah ITS rDNA, EF1-α, ACT, TUB, dan HIS menunjukkan bahwa dua strain Cercospora teridentifikasi secara molekuler sebagai independen spesies tetapi dibutuhkan data morfologi lebih lanjut untuk validasi kandidat spesies baru. Diaporthe spp. morfotipe InaCC F-236, InaCC F-238, InaCC-F239, dan InaCC F-2310 juga dipromosikan sebagai kandidat spesies baru berdasarkan analisis kombinasi daerah ITS rDNA dan gen EF1-α. Penelitian ini menunjukkan bahwa pendekatan multigen dapat memberikan informasi yang lebih tepat dan akurat. Ketika pendekatan ini gagal untuk identifikasi spesies, gen lain harus disertakan dalam analisis filogenetik. Pendekatan awal aplikasi polifasik dalam penelitian ini terbatas pada Diaporthe spp. Hasil menunjukkan bahwa pengelompokkan alkaloid tidak mendukung pengelompokan filogenetik, kecuali untuk Diaporthe sp. M70–96. Hal ini berarti bahwa produksi alkaloid sinkona lebih tergantung pada strain daripada spesies.