Isolasi, Karakterisasi dan Produksi B-Mananse Ekstraseluler dari Geobacillus stearothermophillus L-07

Abstract

Tujuan penelitian ini adalah untuk: (1) melakukan isolasi bakteri termofilik pendegradasi manan yang berasal dari limbah cangkang sawit di pabrik kelapa sawit, (2) analisa karakteristik biokimia ẞ-mananase ekstraseluler, (3) produksi ẞ-mananase dari isolat tersebut. Seleksi dilakukan di medium pengkaya yang mengandung 1% (b/v) bungkil sawit selama 2 hari pada suhu 70°C. Hasil seleksi dan isolasi diperoleh satu isolat bakteri L-07 pendegradasi manan. yang menghasilkan ẞ-mananase. Identifikasi secara mikrobiologi dan analisis sekuen gen 16S-rRNA menunjukkan bahwa L-07 98.5% mirip dengan Geobacillus stearothermophilus, spesies bakteri yang hidup pada kondisi aerob termofilik. ẞ-mananase (endo-1,4-B-D-mananase, EC 3.2.1.78) ekstraseluler diproduksi oleh G. stearothermophilus L-07 pada medium locust bean gum sebagai sumber manan. Sebelum dikarakterisasi ẞ-mananase tersebut dipekatkan dengan pengendapan amonium sulfat. Kemudian kompleks enzim tersebut dipurifikasi dengan kromatografi kolom penukar ion (DEAE sephadex A-50) dan gel filtrasi (Sephadex G-100). Purifikasi menggunakan kromatografi kolom penukar ion DEAE Sephadex A-50 dengan gradasi NaCl bertingkat (0.2, 0.3, dan 0.4 M) dihasilkan tiga fraksi aktif. Hasil akhir pemurnian terhadap fraksi kedua dengan kromatografi gel filtrasi sephadex G-100 menghasilkan satu fraksi aktif utama. Aktivitas ẞ-mananase pada pH optimal 6.0 setelah pengendapan amonium sulfat dan berubah menjadi pH 7.0 setelah dipurifikasi. Demikian juga suhu optimum 80°C pada enzim dari pengendapan amonium sulfat berubah menjadi 70°C pada enzim murni. Enzim tersebut tidak stabil pada suhu 80°C, dan tidak terdeteksi setelah 30 menit inkubasi, Namun enzim tersebut stabil pada suhu 70°C. Pada suhu tersebut, aktivitasnya menurun sampai 57% selama 240 menit, sedangkan penambahan 1 M NaCl mananase masih memberikan aktivitas 97%. Pada pH 4.0 sampai 8.0 enzim tersebut relatif stabil pada kisaran 89% setelah diinkubasi pada suhu 28°C selama 30 menit. Fraksi hasil pemurnian kemudian di-running dengan elektroforesis gel poliakrilamid sodium dodesil sulfat (SDS-PAGE) dan dianalisis zymogram dengan menggunakan substrat locust bean gum. Enzim hasil pemurnian tersebut terdiri atas dua molekul protein masing-masing dengan berat 73 kDa dan 85 kDa. Enzim tersebut merupakan endohidrolase yang mengkatalisis pemotongan ikatan ẞ-1,4-manosidik pada rantai utama galaktomanan menjadi manotriose, manobiose, dan manose. Diantara bungkil sawit, umbi suweg dan kolang-kaling, medium yang mengandung locust bean gum merupakan medium terbaik untuk produksi ẞ-1,4-mananase ekstraseluler. G. stearothermophilus tidak memproduksi ẞ-mananase di medium bungkil sawit. Bakteri tersebut juga tidak tumbuh pada bungkil sawit yang telah dihilangkan lemak atau ion logamnya. Dari pengamatan awal diduga bahwa bungkil sawit mengeluarkan senyawa penghambat setelah disterilisasi autoklaf. Namun, ketika G. stearothermophilus L-07 dan Bacillus thermoleovorans IT-08 dikultur bersama di medium bungkil sawit, ẞ-mananase diproduksi G. stearothermophilus L-07. Dalam kultur bersama tersebut diduga B. thermoleovorans IT-08 menetralisir senyawa penghambat di bungkil sawit sehingga G. stearothermophilus L-07 dapat tumbuh dan menghasilkan ẞ-mananase.