Studi Over-ekspresi Gen Penyandi Hormon Pertumbuhan Melalui Elektroporasi Sperma untuk Membuat Ikan Patin Siam Transgenik Cepat Tumbuh
Study on Over Expression of Gene Encoding Growth Hormone by Sperm Electroporation to Produce Transgenic Fast-Growing Stripped Catfish. Under direction
Date
2010Author
Dewi, Raden Roro Sri Pudji Sinarni
Sumantadinata, Komar
Sudrajat, Agus Oman
Alimuddin
Metadata
Show full item recordAbstract
Ikan patin siam (Pangasionodon hypophthalmus) merupakan salah satu spesies ikan air tawar yang memiliki nilai ekonomis tinggi di Indonesia. Dalam program peningkatan produksi perikanan budidaya tahun 2014, ikan patin menempati urutan ke-3 dengan target peningkatan produksi sebesar 70%/tahun. Berbagai penelitian yang bisa mendukung program Kementerian Kelautan dan Perikanan tersebut telah dilakukan pada bidang nutrisi, reproduksi dan lingkungan. Sementara itu, penelitian di bidang genetika dalam rangka memperoleh benih unggul masih dalam tahap permulaan. Penggunaan teknologi transgenesis terbukti mampu meningkatkan pertumbuhan spesies ikan budidaya sampai beberapa kali lipat. Pada penelitian ini, transgenesis digunakan untuk meningkatkan pertumbuhan ikan patin siam. Penelitian dilakukan melalui beberapa tahapan yaitu: kloning gen penyandi hormon pertumbuhan ikan patin siam (PhGH), optimalisasi kondisi elektroporasi dengan menggunakan sperma sebagai perantara transfer gen, pembuatan konstruksi gen dan transfer gen pCcBA-PhGH dengan menggunakan metode elektroporasi melalui sperma, serta analisis ekspresi gen PhGH secara genotipe dan fenotipe. Gen PhGH diisolasi dari kelenjar pituitari menggunakan metode RT-PCR. Pembacaan sekuens nukleotida gen PhGH dilakukan dengan menggunakan mesin ABIPRISM 3100. Analisa homologi sekuens nukleotida dan deduksi asam amino ikan patin siam dengan ikan lainnya dilakukan dengan menggunakan program BLAST N/P dan Genetyx versi 7. Sekuens gen PhGH selanjutnya disambungkan dengan promoter β-aktin ikan mas (pCcBA). Konstruksi gen pCcBA-PhGH dikembangkan dari konstruksi gen pCcBA-OgGH. Hasil penelitian menunjukkan sekuens nukleotida gen PhGH ikan patin siam tersusun atas 1148 bp yang terdiri dari 603 bp daerah pengkodean (ORF, open reading frame), 18 bp daerah yang tidak dikodekan pada bagian ujung 5’, dan 527 bp pada ujung 3’. Gen PhGH memiliki beberapa ciri seperti halnya gen GH ikan umumnya yaitu: residu tryptophan (W) tunggal pada asam amino ke-104, 5 residu sistein (C) pada asam amino ke-71, 135, 173,190, dan 198, serta motif Asn-Xaa-Thr pada terminal C yang berpotensi sebagai lokasi N-linked glycosilation. Transfer gen dilakukan menggunakan teknik elektroporasi dengan menggunakan sperma yang berperan sebagai perantara. Pengujian berbagai kondisi elektroporasi dilakukan dengan menggunakan gen EGFP (enhanced green fluorescent protein), yang berperan sebagai reporter gene, yang dikendalikan oleh promoter β-aktin ikan mas. Elektroporasi dilakukan dengan menguji kombinasi berbagai tingkat kuat medan listrik (125; 187,5 dan 250 V/cm) dan jumlah kejutan (1 dan 3). Beberapa parameter yang diukur untuk menentukan keberhasilan elektroporasi adalah motilitas spermatozoa, kelangsungan hidup spermatozoa dan deteksi keberadaan gen EGFP pada sperma dan larva. Kemampuan promoter β- aktin ikan mas diukur melalui analisis ekspresi gen EGFP dengan menggunakan teknik PCR semi kuantitatif. Pengujian berbagai kombinasi kuat medan listrik dan jumlah kejutan listrik dengan menggunakan gen EGFP menunjukkan sperma yang dielektroporasi dengan kuat medan listrik 125 V/cm memiliki nilai motilitas dan derajat penetasan telur yang tidak berbeda dengan sperma yang tidak dielektroporasi. Deteksi keberadaan gen EGFP pada larva yang berasal dari telur yang dibuahi sperma yang dielektroporasi menunjukkan bahwa transgen berhasil ditransfer ke dalam ikan resipien. Aktivitas promoter β-aktin ikan mas diukur berdasarkan ekspresi sementara (transient expression) gen EGFP pada embrio dan larva ikan patin siam. Promoter β-aktin ikan mas mampu mengaktifkan transkripsi gen EGFP. Percobaan uji aktivitas promoter β-aktin ikan mas pada embrio dan larva ikan patin siam menunjukkan bahwa ekspresi gen EGFP mencapai puncaknya pada fase neurula dan menurun pada fase larva. Kondisi elektroporasi yang optimal digunakan untuk mentransfer gen PhGH yang ada dalam konstruksi pCcBA-PhGH ke dalam sperma ikan patin siam. Pengujian berbagai konsentrasi DNA plasmid (10, 50 dan 90 μg/ml) dilakukan untuk mendapatkan konsentrasi DNA optimal dengan tingkat keberhasilan transfer gen terbaik. Ekspresi gen PhGH eksogen diukur secara genotipe yaitu melalui ekspresi mRNA PhGH dan secara fenotipe yaitu melalui pengukuran bobot tubuh ikan transgenik dan non-transgenik. Pengujian berbagai tingkat konsentrasi DNA plasmid menunjukkan bahwa konsentrasi DNA plasmid dalam larutan mempengaruhi keberhasilan transfer gen PhGH dan ekspresi gen PhGH eksogen secara fenotipe. Pada konsentrasi DNA plasmid 90 μg/ml, keberhasilan transfer gen PhGH eksogen 85,71% dengan bobot rata-rata juvenil ikan transgenik umur 2 bulan 19% lebih berat dibandingkan dengan yang non-transgenik. Adapun pada juvenil umur 4 bulan, rataan bobot populasi yang diberi perlakuan DNA plasmid dengan konsentrasi 90 μg/ml bobotnya lebih berat 53,38% dibandingkan kontrol. Dengan demikian laju pertumbuhan ikan patin siam dapat ditingkatkan melalui over-ekspresi gen penyandi hormon pertumbuhan, dan budidaya ikan patin siam dengan karakter tumbuh cepat diduga dapat meningkatkan produksinya secara signifikan Stripped catfish (Pangasionodon hypophthalmus) is one of freshwater fish species that has high economic value in Indonesia. Limited attention has been paid to increase the growth of stripped catfish towards enhancement of its aquaculture productivity. In this research, we developed transgenesis technology to produce stripped catfish transgenic F0 as a material to obtain stable line transgenic fish with an improved growth rate character. Research was conducted in some steps: cloning and characterization of gene encoding stripped catfish growth hormone (PhGH), making of all–fish gene construction which consist of PhGH cDNA (complementary DNA) directed by carp β-actin promoter (pCcBA), developing electroporation technique using sperm mediated gene transfer (SMGT) and screening stripped catfish juvenile which carrying PhGH exogenous gene by PCR and RT-PCR methods. Complementary DNA encoding PhGH was isolated from pituitary by RT-PCR method. The size of PhGH cDNA was 1148 bp which consisted of 603 bp of ORF (open reading frame) and encoded 200 amino acid residues. PhGH gene has common characteristic like others teleost GH gene. To make all-fish gene construction of pCcBA-PhGH, PhGH cDNA was ligated with carp β-actin promoter (pCcBA). The size of pCcBA-PhGH construction was 6.6 kb. Increasing in electric field strength on sperm electroporation caused a decrease in sperm motility and embryos hatchling. Higher sperm motility and embryos hatchling were obtained at the electric field strength of 125 V/cm. Increasing concentrations of plasmid DNA caused an increase in the number of individuals carrying the exogenous PhGH gene. Electroporation using plasmid DNA concentration of 90 μg/ml effectively produced transgenic F0. Further, ectopic expression of exogenous PhGH in transgenic fish F0 at 2 months old increased 19-22.6% of their body weight compared to non-transgenic. Average body weight of 4 months juvenile treated with 90 μg/ml of DNA plasmid was 53.38% heavier than control. Therefore, stripped catfish growth rate could be increased by over expression of gene encoding growth hormone. Then, followed by stable transgenic stripped catfish generation, their culture production suggested to be increased significantly.
Collections
- DT - Fisheries [711]