Deteksi Diferensial Potyvirus dan Fabavirus dengan Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RTPCR)

Abstract

Tanaman nilam (Pogostemon cablin Benth) sangat potensial untuk dikembangkan karena minyak nilam merupakan bahan baku yang penting dalam industri. Terdapat banyak kendala dalam upaya peningkatan pengembangan produksi tanaman nilam, salah satunya adalah adanya gangguan dari organisme pengganggu tumbuhan (OPT). Potyvirus dan Fabavirus merupakan virus yang yang sudah diketahui dapat menyerang tanaman nilam. Gejala yang ditimbulkan pada tanaman nilam oleh kedua virus ini hampir tidak bisa dibedakan. Penelitian ini bertujuan untuk menyiapkan metode diferensial yang dapat membedakan dengan tepat infeksi Potyvirus dan Fabavirus pada tanaman nilam baik secara tunggal maupun ganda melalui RT-PCR. Sumber virus merupakan tanaman nilam yang terinfeksi alami Potyvirus atau Fabavirus yang telah diverifikasi dengan uji serologi. RNA total diekstraksi dari tanaman nilam sumber virus dengan Bench- Top Protocols for Xprep Plant RNA Mini Kit (PKT Korea). cDNA (complementary DNA) disintesis dengan teknik Reverse Transcription (RT). PCR dilakukan dengan satu siklus pada 95 ºC selama 5 menit; 10 siklus pada 95 ºC selama 1 menit, pada 51 ºC selama 1 menit, dan pada 72 ºC selama 1 menit; 30 siklus pada 94 ºC selama 1 menit, pada 54 ºC selama 1 menit, dan pada 72 ºC selama 2 menit untuk; dan satu siklus pada 72 ºC selama 10 menit. Primer yang digunakan untuk deteksi Potyvirus adalah CPUP-F (5’-TGAGGATCCTGGTGY ATHGARAAYGG-3’, Y=C/T, H=A/T/C, R=A/G), CP9502-R (5’-GCGGATCCT TTTTTTTTTTTTTTTT-3’) dan untuk Fabavirus adalah BBWVVSSP (5’- GTBTCDAGTGCTYTDGAAGG-3’,B=C/G/T,D=A/G/T,Y=C/T),BBWVKMRM (5’-TDGWDCCATCVAGICKCATTTT-3’, W=A/T; V=A/C/G; I=Inosine; K=G/T). Kedua pasang primer ini dapat mengamplifikasi masing-masing genom Potyvirus sepanjang 800 bp maupun Fabavirus sepanjang 322 bp secara spesifik baik dalam uji terpisah maupun campuran. Metode deteksi diferensial ini berhasil diterapkan untuk mendeteksi infeksi Potyvirus dan Fabavirus pada sampel tanaman nilam bergejala mosaik yang dikoleksi dari wilayah Bogor yaitu Gunung Bunder dan Cicurug. Pada deteksi tersebut dengan jelas dapat dibedakan tanamantanaman yang hanya terinfeksi Potyvirus atau Fabavirus saja atau terinfeksi ganda kedua virus tersebut. Oleh karena itu, metode berbasis RT-PCR menggunakan campuran pasangan primer CPUP-F/CP952-R dan BBWVVSSP/BBWVKMRM valid digunakan untuk deteksi diferensial.