Metode Optimum Analisis Gen Ketahanan Tanaman Cabai terhadap Infeksi Begomovirus menggunakan Metode Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction

Abstract

Analisis ekspresi gen menggunakan real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) memerlukan RNA berkualitas tinggi untuk menghasilkan data yang akurat dan andal. Penelitian ini bertujuan untuk (1) mengevaluasi kualitas RNA total tanaman cabai berdasarkan metode ekstraksi RNA, kondisi sampel, dan kondisi tanaman, serta (2) menganalisis ekspresi gen yang berperan dalam ketahanan tanaman pada berbagai kondisi sampel dan kondisi tanaman menggunakan metode ekstraksi RNA terbaik. Penelitian menggunakan rancangan faktorial 2 × 2 × 2 dengan tiga faktor, yaitu metode ekstraksi RNA (CTAB dan kit Geneaid), kondisi sampel (segar dan penyimpanan pada suhu ultra-rendah -80 °C), serta kondisi tanaman (sehat dan terinfeksi Begomovirus). Kualitas RNA dievaluasi berdasarkan konsentrasi, kemurnian, dan integritas, sedangkan ekspresi gen CaSBP11 dan CaSABP2-1 dianalisis menggunakan RT-qPCR. Hasil penelitian menunjukkan bahwa metode CTAB menghasilkan konsentrasi RNA yang lebih tinggi, sedangkan kit Geneaid menghasilkan RNA dengan tingkat kemurnian dan integritas yang lebih baik sehingga dipilih untuk analisis ekspresi gen. Penyimpanan sampel pada suhu ultra-rendah mampu mempertahankan kualitas RNA sehingga dapat digunakan sebagai alternatif pengganti sampel segar. Peningkatan ekspresi relatif gen CaSBP11 dan CaSABP2-1 menunjukkan bahwa infeksi Begomovirus menginduksi mekanisme pertahanan pada tanaman cabai. Metode ekstraksi RNA yang telah dioptimalkan serta penggunaan primer yang spesifik dapat dimanfaatkan untuk analisis lebih lanjut dalam seleksi sumber ketahanan terhadap infeksi Begomovirus.

Gene expression analysis using real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) requires high-quality RNA to ensure accurate and reliable results. This study aimed to (1) evaluate the quality of chili pepper’s total RNA based on RNA extraction method, sample and plant condition, and (2) analyze the expression of resistance-related genes under different sample and plant conditions using the best RNA extraction method. A 2 × 2 × 2 factorial design was employed with three factors, i.e. RNA extraction method (CTAB and Geneaid kit), sample condition (fresh and ultra-low temperature storage at -80 °C), and plant condition (healthy and Begomovirus-infected). RNA quality was assessed based on concentration, purity, and integrity, while the expression of CaSBP11 and CaSABP2-1 was analyzed using RT-qPCR. The results showed that the CTAB method produced higher RNA concentrations, whereas the Geneaid kit yielded RNA with better purity and integrity and was therefore selected for gene expression analysis. Samples stored at an ultra-low temperature effectively preserved RNA quality and can be used as an alternative for fresh samples. The increase in relative expression of CaSBP11 and CaSABP2-1 indicated that Begomovirus infection induces a defense mechanism of chili plants. The optimized RNA extraction method and the use in selective primers can be used for further assays in selecting sources of resistance to Begomovirus infection.