Induksi Kalus, Regenerasi, dan Multiplikasi Tunas Vanilla planifolia pada Beberapa Komposisi ZPT secara In Vitro

Abstract

Vanilla planifolia merupakan tanaman rempah paling berharga kedua secara global setelah saffron dan bernilai ekonomi karena kandungan senyawa vanilin pada polongnya. Perbanyakan vanili menggunakan stek batang dinilai kurang efisien karena membutuhkan lahan luas, waktu lama, dan bahan tanam lebih banyak. Permasalahan lain yaitu viabilitas dan daya kecambah biji vanili yang rendah karena tidak memiliki endosperma. Kultur jaringan menjadi salah satu alternatif untuk memproduksi bibit vanili secara cepat, seragam, dan bebas patogen. Organogenesis vanili, khusus melalui induksi kalus, juga dapat dimanfaatkan untuk mendapatkan keragaman genetik melalui variasi somaklonal. Kalus hasil induksi dapat diarahkan kepada beberapa tujuan lain seperti induksi mutasi, kultur suspensi sel, kultur protoplas, dan transformasi gen. Penelitian ini bertujuan mempelajari pengaruh jenis eksplan dan komposisi ZPT terhadap induksi dan regenerasi kalus serta multiplikasi tunas vanili varietas Vania I secara in vitro.

Percobaan 1 merupakan percobaan organogenesis vanili tidak langsung melalui induksi kalus. Percobaan ini terdiri atas 3 sub-percobaan. Percobaan 1a dan 1b merupakan percobaan induksi kalus vanili yang disusun dalam Rancangan Kelompok Lengkap Teracak (RKLT) dua faktor. Sub-percobaan 1a menggunakan eksplan ruas, sedangkan sub-percobaan 1b menggunakan eksplan daun yang diperoleh dari planlet vanili in vitro varietas Vania 1 untuk induksi kalus. Faktor pertama pada masing-masing sub percobaan adalah posisi eksplan (atas, tengah, dan bawah). Posisi eksplan atas diambil dari ruas atau daun pada buku ke 1-2 di bawah pucuk; eksplan tengah diambil dari bagian antara buku ke 3-4; dan eksplan bawah diambil dari bagian antara buku ke-5 sampai basal planlet. Faktor kedua adalah komposisi zat pengaruh tumbuh: kontrol tanpa ZPT (Z0); 4,52 µM 2,4-D + 2,27 µM TDZ (Z1); 9,04 µM 2,4-D + 2,27 µM TDZ (Z2); 4,52 µM picloram + 2,27 µM TDZ (Z3); 9,04 µM picloram + 2,27 µM TDZ (Z4); 9,04 µM NAA + 9,04 µM BAP (Z5); dan 9,04 µM TDZ (Z6). Percobaan induksi dilakukan dengan tiga tahapan kerja, yaitu persiapan alat dan media tanam, penanaman bahan tanam ke dalam media induksi kalus, sampai proliferasi kalus.

Proliferasi kalus vanili dilakukan untuk memperbanyak jumlah bahan tanam dan menyeleksi kalus terbaik untuk diregenerasikan. Eksplan yang digunakan untuk proliferasi berupa kalus kompak yang berasal dari ruas. Kalus tersebut dipindahkan ke media proliferasi ½ MS + 4,64 µM kinetin + 0,54 µM NAA dan disubkultur sebanyak 3 kali dengan interval waktu 1 bulan pada media proliferasi yang sama. Luas kalus dan perubahan warna kalus dievaluasi pada setiap kali subkultur.

Percobaan 1c merupakan percobaan regenerasi kalus vanili yang diinduksi dari eksplan ruas. Percobaan ini disusun menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan faktor tunggal yaitu jenis dan konsentrasi sitokinin yang terdiri atas 5 media: kontrol tanpa sitokinin (MS0), 9,30 µM Kinetin, 13,82 µM Kinetin, 8,88 µM BAP, dan 13.32 µM BAP. Kemampuan regenerasi kalus, jumlah tunas, dan akar vanili pada setiap media regenerasi diamati selama 12 MSK.

Percobaan 2 merupakan multiplikasi tunas aksilar vanili secara in vitro. Percobaan ini dirancang menggunakan Rancangan Kelompok Lengkap Teracak (RKLT) dua faktor. Faktor pertama adalah konsentrasi NAA (0; 2,68; dan 8,05 µM), sedangkan faktor kedua adalah konsentrasi BAP (4,44; 8,88; dan 13,32 µM). Kemampuan multiplikasi eksplan dievaluasi berdasarkan variabel jumlah tunas, akar, dan daun vanili yang terbentuk selama 12 MSK.

Respons induksi kalus pada percobaan 1a dan 1b menunjukkan bahwa penggunaan eksplan ruas maupun daun in vitro vanili memberikan pengaruh yang sama terhadap induksi kalus vanili. Penggunaan eksplan ruas bawah menghasilkan persentase pembentukan kalus tertinggi (22,9%) dibandingkan ruas atas dan tengah. Respons induksi kalus vanili tertinggi dalam penelitian ini diperoleh pada komposisi media MS + 9,04 µM picloram + 2,27 µM TDZ dengan persentase keberhasilan pembentukan kalus sebesar 22,2% pada eksplan ruas dan 15,0% pada eksplan daun. Tipe kalus yang diperoleh dalam penelitian ini terbagi menjadi dua yaitu (i) kalus kompak berwarna putih yang dominan terbentuk dari eksplan ruas vanili; dan (ii) kalus remah berwarna hijau transparan dari eksplan ruas muda dan tengah, serta eksplan daun vanili.

Kalus vanili yang berasal dari eksplan ruas dipindahkan ke media proliferasi ½ MS + kinetin + NAA. Ukuran kalus bertambah secara cepat sejak minggu ketiga pada subkultur I hingga subkultur II. Perubahan warna kalus vanili menuju senesens mulai terjadi pada subkultur III. Kalus kompak vanili berwarna putih sampai putih krem dipilih untuk diregenerasikan menjadi tunas. Kalus tersebut dipindahkan ke media regenerasi yang mengandung sitokinin BAP atau kinetin. Hasil percobaan 1c menunjukkan bahwa media MS dengan penambahan BAP 8,88 µM menghasilkan respons regenerasi tunas tertinggi sebesar 50% dan rata-rata jumlah tunas 1,33 tunas per kalus dengan tinggi 3,18 mm. Penggunaan BAP dinilai lebih efektif dibandingkan kinetin dilihat dari persentase respons kalus vanili membentuk tunas maupun akar. Media kontrol MS0 tidak menunjukkan regenerasi tunas, namun hanya menghasilkan respons pembentukan akar sebesar 8,33% dengan panjang akar 1,48 mm.

Hasil percobaan 2 menunjukkan bahwa daya multiplikasi tunas vanili dengan mikrostek dipengaruhi oleh konsentrasi BAP yang digunakan. Faktor tunggal NAA maupun interaksinya dengan BAP tidak mempengaruhi jumlah tunas vanili yang terbentuk. Penambahan BAP 4,44 µM ke dalam media MS menghasilkan rerata jumlah tunas vanili tertinggi yaitu 2,2 tunas per eksplan selama 12 minggu kultur. Jalur multiplikasi tunas vanili menggunakan mikrostek cenderung lebih efisien karena kemampuan regenerasi tunas lebih cepat dibandingkan organogenesis tidak langsung melalui induksi kalus. Organogenesis tidak langsung melalui induksi kalus memiliki keunggulan lain dalam fleksibilitas penggunaan jenis eksplan serta berpotensi dimanfaatkan dalam berbagai aplikasi bioteknologi lanjutan pada berbagai spesies tanaman.

Penelitian ini menghasilkan informasi protokol perbanyakan vanili secara in vitro melalui organogenesis tidak langsung dengan induksi kalus dan multiplikasi tunas aksilar vanili. Protokol dalam penelitian ini dapat menjadi dasar bagi penerapan bioteknologi lanjutan seperti mutagenesis, transformasi genetik, atau produksi senyawa metabolit sekunder untuk menghasilkan kalus atau planlet sebagai bahan tanam. Informasi protokol multiplikasi tunas dapat digunakan untuk penyediaan bibit vanili, namun masih membutuhkan informasi tambahan terkait metode elongasi, perakaran, dan aklimatisasi yang optimal. Penggunaan protokol induksi dan regenerasi kalus, yang melibatkan ZPT sintetik seperti picloram dan TDZ pada konsentrasi tinggi, memerlukan pengujian kestabilan genetik sebelum diterapkan sebagai protokol penyediaan bibit yang seragam.

Vanilla planifolia is the second most valuable spice crop worldwide after saffron, with economic value derived from the vanillin content in its pods. Conventional propagation through stem cuttings is considered inefficient because it requires extensive planting area, prolonged production time, and a large amount of planting material. Another problem is the low viability and germination rate of vanilla seeds, which lack an endosperm. Plant tissue culture represents an alternative approach for the rapid production of genetically uniform and pathogen free vanilla planting materials. In vitro vanilla organogenesis, particularly through callus induction, can also be utilized to generate genetic diversity through somaclonal variation. Induced callus can be directed toward other applications such as mutation induction, cell suspension culture, protoplast culture, and genetic transformation. This study aims to investigate the effects of explant type and plant growth regulator (PGR) composition on callus induction and regeneration, as well as the in vitro multiplication of shoots from the vanilla cultivar vania 1.

Experiment 1 investigated Indirect organogenesis of vanilla through callus induction and consisted of three sub-experiments. Sub-experiments 1a and 1b evaluated vanilla callus induction using a two-factor completely randomized block design (CRBD). Sub-experiment 1a used node explants, while sub-experiment 1b used leaf explants obtained from in vitro plantlets of vanilla cv. Vania 1. The first factor in each sub-experiment was the explant position (upper, middle, basal). The upper explants were collected from internode or leaf at the first and second node below the shoot apex; middle explants from the third and fourth nodes; and basal explants from the fifth nodes to the basal region of the mother plantlet. The second factor was the composition of the growth-promoting agents: control (Z0); 4,52 µM 2,4-D + 2,27 µM TDZ (Z1); 9,04 µM 2,4-D + 2,27 µM TDZ (Z2); 4,52 µM picloram + 2,27 µM TDZ (Z3); 9,04 µM picloram + 2,27 µM TDZ (Z4); 9,04 µM NAA + 9,04 µM BAP (Z5); and 9,04 µM TDZ (Z6). The experiment was conducted in three stages: preparation of the growth medium, planting of the plant material on the callus induction medium, and callus proliferation.

Vanilla callus proliferation was conducted to increase the amount of propagative material and to select the most suitable calli for regeneration. Compact calli derived from internode explant were transferred to a proliferation medium of ½ MS + 4,64 µM kinetin + 0,54 µM NAA and subcultured three times at one-month intervals. Callus area and color changes were evaluated at each subculture. Sub experiment 1c evaluated the regeneration of vanilla callus induced from internode explants. The experiment was arranged in a completely randomized design (CRD) with a single factor, cytokinin type, consisting of a control medium (MS0), 9,30 µM kinetin, 13,82 µM kinetin, 8,88 µM BAP, and 13,32 µM BAP. Regeneration responses of callus regeneration, number of shoots, and roots produced were evaluated over a 12- week culture period.

Experiment 2 investigate the in vitro multiplication of vanilla axillary shoots. The experiment was arranged in a two factor randomized complete blok design (RCBD). The first factor was NAA concentration (0; 2.68; and 8.05 µM), while the second factor was BAP concentration (4.44; 8.88; and 13.32 µM). Explant multiplication was evaluated based on the number of shoots, roots, and leaves produced during 12 weeks after culture.

The results of experiments 1a and 1b showed that the use of both node and leaf explants from in vitro vanilla plantlets resulted in similar callus induction responses. Basal internode explants produced the highest callus formation percentage (22.9%) compared to the upper and middle internodes. The highest callus induction response was obtained on MS medium formulation containing 9.04 µM picloram and 2.27 µM TDZ, with a callus formation percentages of 22.2% for node explants and 15.0% for leaf explants. Two types of callus were obtained in this study: (i) compact, white callus, which predominantly formed from vanilla node explants; and (ii) crumbly, translucent green callus from young and middle node explants, as well as vanilla leaf explants.

Vanilla calli derived from nodal explant were transferred to proliferation medium half-strength MS supplement with kinetin and NAA. Callus size increased rapidly from the third week during subculture I through subculture II. Changes in callus color associated with senescence began to occur during the subculture III. Compact white to cream-white calli were selected for shoot regeneration. The selected calli were transferred to regeneration media containing either BAP or kinetin. The results of sub-experiment 1c showed that MS medium supplemented with 8,88 µM produced the highest shoot regeneration response (50%), with average of 1,33 shoots per callus and a mean shoot height of 3,18 mm. BAP was considered more effective than kinetin in promoting both shoot and root regeneration. The control medium (MS0) did not induce shoot regeneration but produced a root formation response of only 8,33$, with an average root length of 1,48 mm.

The results of Experiment 2 showed that the multiplication rate of vanilla shoots using microcuttings was influenced by the concentration of BAP used. NAA concentration alone and its interaction with BAP did not significantly affected the number of vanilla shoots formed. The MS medium supplemented with 4.44 µM BAP was the best medium for in vitro multiplication of vanilla shoots, yielding 2.2 shoots per explant over 12 weeks of culture. The microcutting-based shoot multiplication pathway tended to be more efficient because shoot regeneration occured more rapidly than through indirect organogenesis via callus induction. Nevertheless, indirect organogenesis through callus induction offers advantages in term of flexibility in explant selection and its potential application in various downstream biotechnological approaches across plant species.

This study provides an information on in vitro vanilla propagation protocols through indirect organogenesis via callus induction and axillary shoot multiplication. The protocols developed in this study may serve as a basis for futher biotechnological applications, including mutagenesis, genetic transformation, and secondary metabolite production, using callus or plantlets as starting materials. The shoot multiplication protocol may utulized for vanilla seedling production. However, futher optimization of shoot elongation, rooting, and acclimatization is required. The use of callus induction and regeneration protocols involving syntetic PGRs such as picloram and TDZ at relatively high concentrations also requires genetic stability assessment before the protocols can be applied for the production of genetically uniform planting materials.