Karakterisasi Genom Lactiplantibacillus plantarum BRIN8 dan Pengaruh Suplementasinya terhadap Fermentasi Rumen secara In Vitro

Abstract

Pelepah kelapa sawit tersedia dalam jumlah besar dan berpotensi dimanfaatkan sebagai sumber pakan dalam sistem integrasi sawit dan sapi. Namun, pemanfaatannya dibatasi oleh kandungan serat yang tinggi dan struktur lignoselulosa yang kompleks, sehingga akses mikroorganisme rumen terhadap komponen karbohidrat menjadi terbatas. Salah satu pendekatan biologis yang dapat digunakan untuk mendukung fermentasi bahan pakan berserat adalah suplementasi bakteri asam laktat. Lactiplantibacillus plantarum BRIN8 merupakan isolat asal rumen sapi Bali yang teradaptasi dengan pakan berbasis hasil samping kelapa sawit. Informasi mengenai karakteristik genom BRIN8 dan pengaruh suplementasinya terhadap fermentasi rumen masih terbatas. Penelitian ini bertujuan mengarakterisasi genom L. plantarum BRIN8, mengevaluasi pengaruh suplementasinya pada dosis berbeda terhadap fermentasi rumen dan kecernaan substrat berbasis pelepah kelapa sawit secara in vitro, serta mengintegrasikan informasi genomik dengan respons fermentasi yang diamati. Penelitian dilakukan melalui karakterisasi genom L. plantarum BRIN8 dan evaluasi fermentasi rumen secara in vitro. Karakterisasi genom meliputi sekuensing genom, perakitan, anotasi gen fungsional, identifikasi carbohydrate-active enzymes (CAZymes), lokus kandidat bakteriosin, determinan resistensi antimikroba, serta analisis genom komparatif dengan delapan strain L. plantarum dari berbagai relung ekologis. Pengujian fermentasi menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) dengan empat taraf suplementasi BRIN8, yaitu 0, 1,0 × 108, 1,0 × 109, dan 1,0 × 1010 CFU/mL, masing-masing dengan lima ulangan. Substrat terdiri atas 60% pelepah kelapa sawit dan 40% konsentrat berdasarkan bahan kering. Parameter yang diamati meliputi produksi dan kinetika gas, pH, konsentrasi NH3-N, total volatile fatty acids (VFA), proporsi VFA individual, serta kecernaan bahan kering dan serat. Rakitan genom BRIN8 berukuran 2,77 Mb dengan 2.571 coding DNA sequences (CDS) serta memiliki tingkat kelengkapan 99,5% berdasarkan BUSCO dan 99,27% berdasarkan CheckM. Anotasi genom menunjukkan keberadaan gen yang berkaitan dengan sistem fosfotransferase, glikolisis, metabolisme laktat, transpor peptida, dan metabolisme asam amino. Sebanyak 66 CAZyme teridentifikasi, termasuk anggota famili GH1, GH13, GH65, GH78, CE1, dan CE4. Fitur tersebut mendukung potensi BRIN8 dalam transpor dan pemanfaatan gula, glikosida, oligosakarida, serta produk antara yang tersedia selama degradasi substrat, tetapi tidak menunjukkan perannya sebagai pendegradasi primer lignoselulosa. Genom BRIN8 juga mengandung lokus kandidat plantaricin yang mencakup plnE, plnF, dan plnK, serta gen yang berkaitan dengan transpor peptida. Analisis Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) tidak mendeteksi determinan resistensi antimikroba yang diperoleh dengan tingkat kepercayaan tinggi. Analisis genom komparatif menunjukkan 2.235 klaster ortolog yang dimiliki bersama oleh seluruh sembilan strain. BRIN8 memiliki 2.496 klaster ortolog dan 67 protein singleton dalam dataset yang dianalisis. Rekonstruksi filogenom menempatkan BRIN8 berdekatan dengan L. plantarum strain UNQLp11. Suplementasi BRIN8 menghasilkan respons fermentasi yang bergantung pada dosis. Akumulasi gas selama fase awal inkubasi lebih rendah pada dosis BRIN8 yang lebih tinggi, tetapi produksi gas kumulatif pada 48 jam tidak berbeda antarperlakuan. Dosis 1,0 × 108 CFU/mL menghasilkan in vitro true digestibility (IVTD), digestible neutral detergent fiber (dNDF), dan neutral detergent fiber digestibility (NDFD) tertinggi secara numerik, tetapi tidak berbeda nyata dari dosis 1,0 × 109 CFU/mL. Peningkatan dosis hingga 1,0 × 1010 CFU/mL tidak meningkatkan kecernaan lebih lanjut. Acid detergent fiber digestibility (ADFD) tidak berbeda antarperlakuan. Total VFA menurun seiring peningkatan dosis BRIN8 dan mencapai nilai terendah pada dosis 1,0 × 1010 CFU/mL. Pada dosis tertinggi, proporsi asetat dan rasio asetat terhadap propionat lebih rendah, sedangkan proporsi propionat, butirat, dan branched-chain VFA (BCVFA) lebih tinggi. Perubahan tersebut menunjukkan redistribusi relatif komposisi VFA dan tidak mencerminkan peningkatan konsentrasi absolut VFA individual karena total VFA menurun. Nilai pH berbeda antarperlakuan, tetapi tetap berada dalam kisaran yang sempit 6,82–6,91. Secara keseluruhan, karakteristik genom BRIN8 menunjukkan potensi metabolik yang terutama berkaitan dengan transpor dan pemanfaatan karbohidrat serta interaksi antarmikroba. Informasi genomik tersebut memberikan konteks biologis terhadap respons fermentasi, tetapi tidak membuktikan keterlibatan langsung gen tertentu selama fermentasi maupun menunjukkan BRIN8 sebagai pendegradasi primer lignoselulosa. Suplementasi BRIN8 memengaruhi fermentasi dan kecernaan substrat secara bergantung pada dosis. Dosis uji 1,0 × 108 CFU/mL menghasilkan nilai IVTD, dNDF, dan NDFD tertinggi secara numerik dan dapat dipertimbangkan sebagai dosis kerja awal untuk evaluasi lebih lanjut. Hasil penelitian ini memberikan dasar bagi pengembangan dan evaluasi lanjutan BRIN8 sebagai kandidat mikroba pendukung fermentasi pakan berbasis pelepah kelapa sawit.

Oil palm fronds are produced in large quantities and have potential as a feed resource in integrated oil palm and cattle production systems. However, their utilization is limited by the high fiber content and complex lignocellulosic structure, which limit microbial access to carbohydrate components in the rumen. Supplementation with lactic acid bacteria is one biological approach that may support the fermentation of fibrous feed. Lactiplantibacillus plantarum BRIN8 was isolated from the rumen of Bali cattle adapted to a diet containing oil palm by-products. Information on the genomic characteristics of BRIN8 and the effects of its supplementation on rumen fermentation remains limited. This study aimed to characterize the genome of L. plantarum BRIN8, evaluate the effects of different supplementation levels on in vitro rumen fermentation and digestibility of an oil palm frond-based substrate, and integrate genomic information with the observed fermentation responses. The study consisted of genome characterization of L. plantarum BRIN8 and an in vitro rumen fermentation evaluation. Genome characterization included genome sequencing, assembly, functional gene annotation, identification of carbohydrate-active enzymes (CAZymes), candidate bacteriocin loci, antimicrobial resistance determinants, and comparative genomic analysis with eight L. plantarum strains originating from different ecological niches. The fermentation experiment was arranged in a completely randomized design with four levels of BRIN8 supplementation, namely 0, 1.0 × 108, 1.0 × 10?, and 1.0 × 10¹°, each with five replicates. The substrate consisted of 60% oil palm fronds and 40% concentrate on a dry matter basis. The measured parameters included gas production and kinetics, pH, NH3-N concentration, total volatile fatty acids (VFA), individual VFA proportions, and dry matter and fiber digestibility. The BRIN8 genome assembly was 2.77 Mb and contained 2,571 coding sequences, with genome completeness of 99.5% based on BUSCO and 99.27% based on CheckM. Genome annotation identified genes associated with the phosphotransferase system, glycolysis, lactate metabolism, peptide transport, and amino acid metabolism. A total of 66 CAZyme annotations were identified, including members of the GH1, GH13, GH65, GH78, CE1, and CE4 families. These genomic features support the potential of BRIN8 to transport and utilize sugars, glycosides, oligosaccharides, and intermediates available during substrate degradation, rather than functioning as a primary lignocellulose degrader. The BRIN8 genome also contained candidate plantaricin loci comprising plnE, plnF, and plnK, together with components associated with peptide transport. Analysis using the Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) did not detect acquired antimicrobial resistance determinants with high confidence. Comparative genomic analysis identified 2,235 orthologous clusters shared by all nine strains. BRIN8 contained 2,496 orthologous clusters and 67 singleton proteins within the analyzed dataset. Phylogenomic reconstruction placed BRIN8 close to strain UNQLp11, which originated from Pinot noir wine. BRIN8 supplementation resulted in dose-dependent responses. Gas accumulation during the early phase of incubation was lower at higher BRIN8 doses, whereas cumulative gas production after 48 h did not differ among treatments. Supplementation at 1.0 × 108 CFU/mL resulted in the numerically highest in vitro true digestibility (IVTD), digestible neutral detergent fiber (dNDF), and neutral detergent fiber digestibility (NDFD) values, although these values did not differ significantly from those obtained at 1.0 × 109 CFU/mL. Increasing the dose to 1.0 × 1010 CFU/mL did not provide further improvement in digestibility. Acid detergent fiber digestibility (ADFD) did not differ among treatments. Total VFA decreased with increasing BRIN8 doses and reached the lowest value at 1.0 × 1010 CFU/mL. At the highest dose, the acetate proportion and acetate-to-propionate ratio were lower, whereas the proportions of propionate, butyrate, and branched-chain VFA (BCVFA) were higher. These changes reflected a relative redistribution of VFA composition rather than an increase in the absolute concentration of individual VFA because total VFA decreased. Rumen pH differed among treatments but remained in a narrow range of 6.82–6.91. Overall, the genomic characteristics of BRIN8 indicate metabolic potential primarily associated with carbohydrate transport and utilization as well as antimicrobial interactions. The genomic information provides biological context for the observed fermentation responses but does not demonstrate the direct involvement of specific genes during fermentation or support a role for BRIN8 as a primary lignocellulose degrader. BRIN8 supplementation affected fermentation and substrate digestibility in a dose-dependent manner. The 1.0 × 108 CFU/mL treatment produced the numerically highest IVTD, dNDF, and NDFD values and may therefore be considered an initial working dose for further evaluation. These findings provide a basis for further development and evaluation of BRIN8 as a candidate supporting microorganism for the fermentation of oil palm frond-based feeds.