Ekspresi Lipase dan Konstruksi Plasmid untuk Mutasi degQ di Cereibacter spheroides 2.4.1

Abstract

Produksi protein rekombinan sangat dipengaruhi oleh karakteristik inang ekspresi yang digunakan. Salah satu faktor yang dapat membatasi efisiensi produksi adalah keberadaan protease inang yang berpotensi mendegradasi protein rekombinan. C. sphaeroides 2.4.1 merupakan bakteri fototrof fakultatif yang berpotensi dikembangkan sebagai inang ekspresi alternatif karena mampu tumbuh pada kondisi aerob maupun anaerob. Namun, kemampuan mengekspresikan protein heterolog dan upaya rekayasa genetik untuk mengurangi pengaruh protease endogen dari inang ini masih memerlukan kajian lebih lanjut. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan mengevaluasi aktivitas volumetrik crude extract dari ekspresi heterolog lipase D2B dan T12 pada C. sphaeroides 2.4.1 serta mengonstruksi perangkat genetik untuk inaktivasi gen degQ sebagai langkah awal pengembangan galur defisien protease. Gen penyandi lipase D2B dari Aneurinibacillus thermoaerophilus dan T12 dari Geobacillus stearothermophilus dikloning ke dalam vektor pRK415 di bawah kendali promotor lacZ dan ditransfer ke C. sphaeroides 2.4.1 melalui konjugasi triparental. Keberhasilan konstruksi dikonfirmasi menggunakan PCR dan analisis restriksi, sedangkan aktivitas volumetrik crude extract lipase dievaluasi pada media agar tributirin dan dikuantifikasi menggunakan substrat p-nitrofenil kaprilat. Selain itu, plasmid bunuh diri pSAW (pSUP202_degQ::sp/smR) dikonstruksi melalui penyisipan kaset degQ::sp/smR ke dalam pSUP202 sebagai perangkat untuk inaktivasi gen degQ melalui rekombinasi homolog. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kedua gen lipase berhasil diekspresikan pada C. sphaeroides 2.4.1, dengan lipase T12 secara konsisten memiliki aktivitas yang lebih tinggi dibandingkan D2B. Akan tetapi, aktivitas volumetrik crude extract kedua lipase pada C. sphaeroides 2.4.1 jauh lebih rendah dibandingkan pada Escherichia coli DH5a, yang menunjukkan bahwa karakteristik inang masih membatasi efisiensi produksi lipase rekombinan. Penelitian ini juga berhasil mengonstruksi plasmid bunuh diri pSAW sebagai perangkat genetik untuk inaktivasi degQ. Secara keseluruhan, penelitian ini menunjukkan potensi C. sphaeroides 2.4.1 sebagai inang ekspresi alternatif sekaligus menyediakan dasar bagi pengembangan galur defisien protease untuk menunjang peningkatan stabilitas dan efisiensi produksi protein rekombinan di inang alternatif.

Recombinant protein production is strongly influenced by the characteristics of the expression host. One factor that may limit production efficiency is the presence of host proteases capable of degrading recombinant proteins. Cereibacter sphaeroides 2.4.1 is a facultative phototrophic bacterium with potential as an alternative expression host because of its ability to grow under both aerobic and anaerobic conditions. However, its capacity to express heterologous proteins and the feasibility of genetic engineering approaches to mitigate the effects of endogenous host proteases remain to be investigated. Therefore, this study aimed to evaluate the relative performance of heterologously expressed lipases D2B and T12 in C. sphaeroides 2.4.1 and to construct a genetic tool for degQ inactivation as an initial step toward developing a protease-deficient strain. The genes encoding lipases D2B from Aneurinibacillus thermoaerophilus and T12 from Geobacillus stearothermophilus were cloned into the pRK415 vector under the control of the lacZ promoter and introduced into C. sphaeroides 2.4.1 via triparental conjugation. Successful construct assembly was confirmed by PCR and restriction analysis. Lipase activity was qualitatively assessed on tributyrin agar and quantitatively determined using p-nitrophenyl caprylate as the substrate. In addition, the suicide plasmid pSAW (pSUP202_degQ::sp/smR) was constructed by inserting the degQ::sp/smR cassette into pSUP202 as a genetic tool for degQ inactivation through homologous recombination. Both lipase genes were successfully expressed in C. sphaeroides 2.4.1, with T12 consistently exhibiting higher activity than D2B. However, the lipase activities measured from crude enzyme extracts of C. sphaeroides 2.4.1 were substantially lower than those observed in Escherichia coli DH5a, indicating that host-specific characteristics may constrain the efficiency of recombinant lipase production. This study also successfully constructed the suicide plasmid pSAW, providing a genetic tool for degQ inactivation. Overall, these findings highlight the potential of C. sphaeroides 2.4.1 as an alternative expression host and provide a foundation for developing a protease-deficient strain to enhance recombinant protein stability and production efficiency in alternative hosts.