Konstruksi Kaset sacB Bacillus sp. asal Kue Talam untuk Sistem Seleksi Negatif pada Escherichia coli

Abstract

Sistem seleksi negatif memanfaatkan gen sacB penyandi levansukrase untuk menyeleksi mutan Escherichia coli tanpa meninggalkan marka resistensi antibiotik melalui eliminasi sel di media yang mengandung sukrosa. Keragaman sekuens homolog sacB dari spesies Bacillus berpotensi menghasilkan tingkat letalitas berbeda, namun pemanfaatannya masih terbatas pada varian sacB Bacillus subtilis. Penelitian ini bertujuan mengisolasi fragmen homolog sacB Bacillus sp. asal kue basah, mengonstruksi kaset sacB berbasis pUC19, serta mengevaluasi letalitasnya pada E. coli DH5a di media sukrosa 5% dengan pMH1701 sebagai kontrol positif. Metode meliputi enrichment Bacillus sp., identifikasi 16S rRNA, desain primer sacB, amplifikasi gen sacB, konstruksi dan karakterisasi kaset sacB, uji letalitas, serta uji kuantitatif dinitrosalicylic acid (DNS). Identifikasi 16S rRNA menunjukkan isolat memiliki kedekatan dengan Bacillus stercoris (99,78%) dan Bacillus amyloliquefaciens (100%), menghasilkan kaset pKDS02 dan pKDS17. Kaset pKDS02 (sacB diduga B. stercoris, orientasi antisense) meloloskan koloni pada spot assay (pengenceran 10?4 dan 10?5) dengan gula pereduksi 0,19 ± 0,01 mg/mL. Kaset pKDS17 (sacB diduga B. amyloliquefaciens, orientasi sense) menunjukkan letalitas total (100%) setara pMH1701, serta menghasilkan gula pereduksi lebih tinggi empat kali (3,27 ± 0,14 mg/mL) dibandingkan pMH1701 (0,74 ± 0,06 mg/mL). Penelitian ini berhasil menghasilkan kaset sacB alternatif non-subtilis sebagai kandidat marka seleksi negatif pada E. coli.