Sintesis, Karakterisasi, dan Uji Efikasi Nanopartikel Kitosan Terhadap Zucchini yellow mosaic virus dan Kutu Daun Vektor Aphis gossypii Glover

Abstract

Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) merupakan salah satu virus penting penyebab penyakit mosaik pada tanaman famili Cucurbitaceae, termasuk mentimun. Kitosan dilaporkan mampu mengendalikan infeksi virus tumbuhan terutama yang ditularkan oleh kutu daun. Namun, penerapan kitosan nanopartikel (Kit-NP) dalam pengelolaan virus masih jarang dikaji, meskipun bentuk nanopartikel (NP) menawarkan keefektifan yang lebih tinggi dan efisien dalam penggunaannya untuk skala lapangan. Penelitian ini bertujuan: (1) menyintesis kitosan nanopartikel berukuran kurang dari 50 nm menggunakan metode gelasi ionik dan modifikasinya serta mengarakterisasi NP, (2) seleksi waktu dan penentuan konsentrasi terbaik NP dalam menekan infeksi ZYMV pada tanaman indikator Chenopodium amaranticolor, (3) mengevaluasi keefektifan Kit-NP dalam mengendalikan infeksi dan penularan ZYMV melalui kutu daun vektor, dan (4) menguji pengaruh Kit-NP terhadap preferensi dan mortalitas kutu daun. Kitosan disintesis dengan metode gelasi ionik menggunakan sodium tripholyphosphate (STPP) 0,1% (b/v) dan dimodifikasi dengan ultrasonikasi (Kit-NP+S) pada 20 kHz selama 5 menit. Karakterisasi NP dilakukan dengan pengamatan high resolution transmission electron microscope (HR-TEM) untuk mengetahui bentuk dan ukuran partikel. Gugus fungsi ditentukan menggunakan fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR), dan analisis zeta potensial menggunakan nano particle size analyzer. Seleksi dan penentuan konsentrasi kitosan (Kit), Kit-NP, dan Kit-NP+S serta waktu aplikasi yang terbaik dilakukan dengan bioassay pada tanaman indikator C. amaranticolor. Waktu aplikasi dilakukan sebelum dan setelah 24 jam tanaman diinokulasi ZYMV. Perlakuan diuji pada konsentrasi 50–300 ppm. Indikator yang diamati yaitu waktu inkubasi, jumlah lesio lokal nekrotik (LLN), dan tingkat hambatan relatif (THR) pembentukan LLN. Efikasi Kitosan (Kit), Kit-NP, dan Kit-NP+S terhadap ZYMV dilakukan dengan penularan virus melalui kutu daun Aphis gossypii Glover viruliferus pada tanaman mentimun di rumah kaca. Konsentrasi terbaik larutan NP dan non-NP disemprotkan pada daun tanaman umur 1 minggu setelah tanam (MST) sebelum inokulasi ZYMV. Indikator yang diamati meliputi periode inkubasi, insidensi penyakit, keparahan penyakit, titer virus (daun dan kutu daun), aktivitas enzim polifenol oksidase (PPO) dan phenilalanine ammonia liase (PAL), kadar klorofil, dan parameter agronomi. Titer virus dideteksi secara serologi dengan metode DAS-ELISA. Kemampuan Kit, Kit-NP, dan Kit-NP+S terhadap preferensi makan dan mortalitas kutu daun Aphis gossypii Glover diuji dengan choice test menggunakan dua konsentrasi terbaik hasil bioassay pada tanaman indikator. Peubah yang diamati yaitu jumlah kutu daun per tanaman pada 1, 3, 6, dan 12 jam setelah infestasi (JSI). Aktivitas insektisidal dilakukan dengan penyemprotan langsung Kit-NP dan diukur persentase mortalitas kutu daun pada 12, 24, dan 48 jam setelah perlakuan (JSP). Kit-NP dan Kit-NP+S berhasil disintesis dengan metode gelasi ionik dan modifikasi ultrasonikasi. Ukuran rata-rata partikel Kit-NP dan Kit-NP+S adalah 7,77 nm dan 3,78 nm dengan morfologi berbentuk sferis dan pola selected area electron diffraction (SAED) yang sama yaitu semi-kristalin. Kitosan dan Kit-NP menunjukkan bilangan gelombang (cm-1) dan ikatan yang sama pada bilangan gelombang 2087 (C=C), 1634 (>N?H), 1277 (C?N), dan 983, 925, 866 (C?H) yang merupakan gugus fungsi hidroksil, alkine internal lemah, amina, aryl (cincin aromatik), dan alkena. Perbedaan bilangan gelombang (cm-1) kitosan terdapat pada 3293 (O?H) dan 1377 (?CH3) yaitu gugus fungsi hidroksil dan alkana, sedangkan Kit-NP pada 3289 (O?H) yaitu gugus fungsi hidroksil, serta Kit-NP memiliki nilai rata-rata zeta potensial sebesar –19,6 mV. Penyemprotan daun C. amaranticolor dengan Kit, Kit-NP, dan Kit-NP+S pada konsentrasi 50–300 ppm sebelum dan setelah inokulasi virus menunjukkan periode inkubasi yang tidak berbeda nyata (5 dan 6 hari setelah inokulasi-HSI) dibandingkan kontrol tanpa perlakuan (5 HSI). Perlakuan NP sebelum inokulasi ZYMV mampu menekan LLN dengan tingkat hambatan relatif berkisar 33,3%-71,7% dibandingkan dengan aplikasi setelah inokulasi virus. Waktu aplikasi dan konsentrasi terbaik NP dalam menekan pembentukan LLN adalah antara 150-200 ppm yang diaplikasikan sebelum inokulasi ZYMV. Berdasarkan hasil efikasi pada tanaman mentimun, perlakuan Kit, Kit-NP, dan Kit-NP+S pada konsentrasi 150–200 ppm sebelum inokulasi ZYMV dapat memperpanjang periode inkubasi dan mengurangi skor keparahan penyakit dibandingkan kontrol sakit dengan keefektifan penghambatan sebesar 26%–54%. Gejala penyakit yang muncul pada tanaman perlakuan menunjukkan gejala ringan (mosaik hijau gelap-terang dan klorosis ringan). Perlakuan Kit, Kit-NP, dan Kit-NP+S pada konsentrasi 150–200 ppm menekan titer virus dibandingkan kontrol sakit, dengan keefektifan berkisar 38,8–61,5%, meskipun tidak berbeda nyata antarperlakuan. Semua perlakuan tidak menghambat kutu daun dalam menularkan ZYMV, tetapi mampu menekan replikasi virus di dalam jaringan tanaman setelah inokulasi. Selain itu, perlakuan Kit-NP dan Kit-NP+S pada konsentrasi 150–200 ppm mampu menginduksi mekanisme pertahanan tanaman melalui peningkatan aktivitas enzim PPO, namun tidak meningkatkan protein PAL. Penyemprotan daun dengan Kit-NP dan Kit-NP+S pada konsentrasi 150–200 ppm menunjukkan jumlah kutu daun nyata lebih sedikit dibandingkan perlakuan Kit 150–200 ppm dan Kit-NP 300 ppm pada 12 JSI. Mortalitas kutu daun yang disemprot langsung dengan Kit, Kit-NP, dan Kit-NP+S pada konsentrasi 150–200 ppm berkisar 35%-70% dan nyata lebih tinggi dibandingkan kontrol tanpa perlakuan pada 48 JSP. Namun antarperlakuan tidak berbeda nyata; perlakuan Kit, Kit-NP, dan Kit-NP+S dengan konsentrasi 150-200 ppm menunjukkan efek non-preferensi yang menghambat kutu daun mendatangi tanaman perlakuan dan bersifat insektisidal terhadap kutu daun.

Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) is one of the important viruses that causes mosaic disease in plants of the Cucurbitaceae family, including cucumbers. Chitosan has been reported to control viral infections, especially those transmitted by aphids. However, the application of chitosan nanoparticles (Chi-NP) for virus management is still rarely studied, even though the nanoparticle (NP) form offers greater effectiveness and efficiency at the field scale. The study aims to: (1) synthesize chitosan nanoparticles measuring less than 50 nm using ionic gelation methods and its modifications and characterize NP, (2) select the time and determine the best concentration of NP in suppressing ZYMV infection in the indicator plant Chenopodium amaranticolor, (3) evaluate the effectiveness of Chi-NP in controlling ZYMV infection and transmission through aphid vectors, and (4) test the effect of Chi-NP on aphid preference and mortality. Chitosan was synthesized by ionic gelation with 0.1% (w/v) sodium tripholyphosphate (STPP) and modified by ultrasonication (Chi-NP+S) at 20 kHz for 5 minutes. NP characterization was performed using a High-resolution transmission electron microscope (HR-TEM) to determine particle shape and size. Functional groups were determined using Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR), and zeta potential analysis using a nanoparticle size analyzer. The selection and determination of the optimal concentrations of chitosan (Chi), Chi-NP, and Chi-NP+S, as well as the application time, were conducted using a bioassay on the indicator plant C. amaranticolor. Application times were determined 24 hours before and after ZYMV inoculation. Treatments were tested at concentrations of 50–300 ppm. The indicators observed were incubation time, the number of local necrotic lesions (NLL), and the relative inhibition level (RIL) of NLL formation. The efficacy of Chitosan (Chi), Chi-NP, and Chi-NP+S against ZYMV was evaluated by inoculating cucumber plants in a greenhouse using viruliferous Aphis gossypii Glover aphids. The optimal concentrations of NP and non-NP solutions were sprayed onto plant leaves one week after planting (WAP), prior to ZYMV inoculation. Observed parameters included the incubation period, disease incidence, disease severity, virus titer (in leaves and aphids), polyphenol oxidase (PPO) and phenylalanine ammonia-lyase (PAL) enzyme activities, chlorophyll content, and agronomic parameters. Virus titers were detected serologically using the DAS-ELISA method. The effects of Chi, Chi-NP, and Chi-NP+S on the feeding preference and mortality of Aphis gossypii Glover aphids were assessed via choice tests, utilizing the two best concentrations identified in the bioassay on indicator plants. The observed variable was the number of aphids per plant at 1, 3, 6, and 12 hours post-infestation (HPI). Insecticidal activity was evaluated through direct spraying of Kit-NP, with aphid mortality percentages measured at 12, 24, and 48 hours post-treatment (HPT). Chi-NP and Chi-NP+S were successfully synthesized by the ionic gelation method and its modification. The average particle sizes of Chi-NP and Chi-NP+S were 7.77 nm and 3.78 nm, respectively, with spherical morphology and the same selected-area electron diffraction (SAED) pattern, namely, semi-crystalline. Chitosan and Chi-NP showed the same wavenumber (cm-1) and bond at wavenumbers of 2087 (C=C), 1634 (>N?H), 1277 (C?N), and 983, 925, 866 (C?H), which are hydroxyl functional groups, weak internal alkynes, amines, aryl (aromatic rings), and alkenes. The difference in wavenumber (cm-1) of chitosan is found at 3293 (O?H) and 1377 (?CH3), namely the hydroxyl and alkane functional groups, while Chi-NP at 3289 (O?H) is the hydroxyl functional group. Chi-NP has an average zeta potential of -19.6 mV. Spraying C. amaranticolor leaves with Chi, Chi-NP, and Chi-NP+S at concentrations of 50–300 ppm before and after virus inoculation showed no significant differences in the incubation period (5 and 6 days after inoculation-DAI) compared to the untreated control (5 DAI). NP treatment before ZYMV inoculation suppressed LLN, with a relative inhibition rate ranging from 33.3% to 71.7%, compared with application after virus inoculation. The optimal application time and concentration of NP to suppress LLN formation were 150-200 ppm, applied before ZYMV inoculation. Based on efficacy results on cucumber plants, treatments with Chi, Chi-NP, and Chi-NP+S at concentrations of 150–200 ppm prior to ZYMV inoculation prolonged the incubation period and reduced disease severity scores compared to the infected control, achieving inhibition rates of 26%–54%. Symptoms observed on treated plants were mild (dark-light green mosaic and mild chlorosis). Treatments with Chi, Chi-NP, and Chi-NP+S at 150–200 ppm suppressed viral titers relative to the infected control, with effectiveness ranging from 38.8% to 61.5%, although no significant differences were observed among the treatments. None of the treatments inhibited aphid-mediated transmission of ZYMV, but they suppressed viral replication within plant tissues post-inoculation. Furthermore, treatments with Chi-NP and Chi-NP+S at 150–200 ppm induced plant defense mechanisms by increasing PPO activity, but did not increase PAL protein levels. Foliar spraying with Chi-NP and Chi-NP+S at 150–200 ppm resulted in significantly lower aphid numbers compared to the Chi (150–200 ppm) and Chi-NP (300 ppm) treatments at 12 hours post-inoculation (HPI). Mortality rates for aphids sprayed directly with Chi, Chi-NP, and Chi-NP+S at 150–200 ppm ranged from 35% to 70%, which were significantly higher than the untreated control at 48 hours post-spraying (HPS); however, there were no significant differences among the treatments. Treatments with Chi, Chi-NP, and Chi-NP+S at 150–200 ppm demonstrated a non-preference effect—deterring aphids from settling on treated plants—and exhibited insecticidal activity against the aphids.