Studi Pengembangan Pengencer Semen Sapi Berbasis Nabati Menggunakan Nano Liposom dari Lesitin Kedelai

Abstract

Liposom untuk mengatasi keterbatasan tersebut, telah diperkenalkan sebagai pengencer alternatif selain pengencer konvensional yang berasal dari hewan. Liposom menguntungkan karena biokompatibilitas, biodegradabilitas, dan sifatnya yang tidak beracun. Ukuran skala nano dan sifat amfifiliknya memungkinkan pembentukan spontan vesikel bilayer yang mampu mengkapsulasi dan mengirimkan senyawa bioaktif. Penerapan nanoteknologi dalam biologi reproduksi memanfaatkan karakter fisikokimia yang khas ini untuk meningkatkan kriopreservasi sperma. Pengencer komersial berbasis liposom meskipun telah tersedia, namun masih impor. Pengembangan pengencer lesitin nabati yang terstandarisasi, seperti nanoliposom (NL) yang berasal dari kedelai, merupakan langkah penting untuk meningkatkan kualitas semen, keamanan bahan biologis, dan penyimpanan jangka panjang dalam program pembibitan ternak di Indonesia. Penelitian ini terbagi beberapa tahap. Tahap pertama bertujuan untuk melakukan analisis partikel lesitin pada pengencer buatan sendiri dan komersial, menggunakan deteksi parameter pola pergerakan sistem Computer Assisted Sperm Analyzer (CASA) dan ukuran partikel pengencer dengan Particle Size Analyzer (PSA). Pengencer yang digunakan dalam penelitian ini adalah Tris Kuning Telur (TKT), Andromed® (Minitube, Jerman), Bovifree® (Minitube, Jerman), OptiXcell® (IMV, Prancis), dan BioXcell® (IMV, Prancis). Hasil penelitian menunjukkan bahwa pengencer Tris kuning telur memiliki rentang ukuran partikel terluas, dari 584,5 ± 2,2 nm hingga 3255,7 ± 48,84 nm, ukuran partikel yang besar ini terdeteksi oleh sistem CASA. Pengencer komersial dengan ukuran partikel terkecil adalah OptiXcell® (64,6 ± 2 nm), diikuti oleh BioXcell® (186,2 ± 2,2 nm), Andromed® (245,7 ± 2,8 nm) dan Bovifree® (278,5 ± 2,5 nm), sehingga tidak terdeteksi oleh sistem CASA. Penelitian kedua bertujuan untuk mengembangkan nanoliposom dari lesitin kedelai menggunakan proses sonikasi dan ultrasentrifugasi. Evaluasi ukuran, kestabilan dan keseragaman distribusi ukuran partikel nanoliposom dengan PSA. Pembuatan Nano Liposom (NL) menggunakan metode probe sonikasi dengan variasi interval waktu 15, 30 dan 45 menit. Partikel NL yang dioptimalkan pada sonikasi selama 45 menit menunjukkan ukuran partikel rata-rata 76±1,95 nm dan kestabilan potensial zeta -43,2±0,25 mV, yang mengkonfirmasi stabilitas elektrostatik yang tinggi dan dispersi koloid yang baik. Keseragaman distribusi ukuran partikel atau Polydispersity Index (PDI) sebesar 0,399±0,020 menunjukkan distribusi ukuran partikel cukup homogen dan stabil (moderat monodisperse). Penilaian morfologi pada partikel NL hasil sonikasi selama 45 menit menggunakan Scanning Electron Microscope (SEM) dan High Resolution Electron Transmission Microscope (HR-TEM) memperlihatkan adanya nanovesikel unilamelar berbentuk bulat yang mampu berinteraksi secara dinamis dengan membran sperma. Penelitian ketiga bertujuan memformulasikan pengencer tris dengan nano liposom sebagai pengencer spermatozoa sapi. Perlakuan formulasi pengencer tris dengan konsentrasi nanoliposom 5, 10, 15, 20 dan 25 mg/mL, dengan parameter yang diamati pada nilai pH, osmolalitas, ukuran dan kestabilan partikel. Formulasi pengencer Tris Nano Liposom (TNL) pada konsentrasi 5-10 mg/mL mampu mempertahankan pH yang normal (6,5–7,5), osmolalitas yang normal (280–320 mOsmol/kg), ukuran partikel nano kurang dari 100 nm dan kestabilan partikel nano lebih kecil dari -30 mV. Nilai Polydispersity Index (PDI) sebesar 0,356-0,395 menunjukkan distribusi ukuran partikel cukup homogen dan stabil (moderat monodisperse). Pengencer TNL selama proses ekuilibrasi dan evaluasi setelah thawing, menunjukkan parameter motilitas total, motilitas progresif, viabilitas, dan kinematik sperma (Velocity curved line (VCL), Velocity straight line (VSL), Velocity average path (VAP), Beat cross frequency (BCF), dan Amplitude of lateral head displacement (ALH)) signifikan lebih tinggi dibandingkan dengan kontrol TKT (P<0,05). Hasil Scanning Electron Microscope (SEM) mengkonfirmasi peningkatan integritas plasma membran dan berkurangnya kelainan pada morfologi dan topografi permukaan sperma yang dikriopreservasi menggunakan TNL. Formulasi TNL 10 mg/mL mampu melindungi akrosom, membran plasma, membran mitokondria dan berkurangnya fragmentasi DNA sperma, menunjukkan perlindungan yang lebih baik terhadap kerusakan akibat proses pembekuan dan thawing. Penelitian keempat bertujuan mengevaluasi efektivitas pengencer TKT dan TNL 10 mg/mL dalam mempertahankan kualitas semen beku sapi bali setelah thawing dari uji coba produksi di BBIB Singosari dan BIBD Riau. Untuk meneliti hubungan antar parameter dan evaluasi perbedaan kelompok antar pengencer, dilakukan analisis korelasi, Principal Component Analysis (PCA) dan Partial Least Squares–Discriminant Analysis (PLS-DA). Kedua jenis pengencer mampu mempertahankan kualitas sperma setelah thawing dengan baik, tanpa perbedaan signifikan (P>0,05) pada motilitas total, viabilitas, integritas membran, integritas akrosom, dan fragmentasi DNA. Parameter kinematika juga tetap berada dalam kisaran optimal, yang menunjukkan bahwa pola gerak progresif dan kurvilinear tetap terjaga. Analisis multivariat (PCA dan PLS-DA) mengidentifikasi motilitas dan integritas membran sebagai kontributor utama variasi kualitas semen secara keseluruhan. Pengencer TNL menghasilkan respons yang lebih stabil dan homogen dibandingkan TKT. Pengencer TNL menunjukkan performa krioprotektif yang sebanding dengan pengencer TKT konvensional, sekaligus memberikan keunggulan tambahan berupa kejernihan, biosekuriti yang lebih baik, dan standarisasi komposisi. Karakteristik ini menonjolkan TNL sebagai alternatif yang layak dan berkelanjutan untuk kriopreservasi semen sapi serta mendukung potensinya untuk penerapan yang lebih luas dalam program inseminasi buatan (IB). Penelitian kelima bertujuan untuk mengetahui kualitas pengencer TNL 10 mg/mL dibandingkan dengan pengencer komersial yaitu: Andromed®, Bovifree® dan OptiXcell®. Hasil evaluasi kualitas semen setelah pembekuan diperoleh motilitas, progresif, kinematik dan keutuhan membran plasma berbeda nyata lebih tinggi (P<0,05) pada pengencer TNL 10 mg/mL dibandingkan pengencer komersial. Pengencer TNL 10 mg/mL mampu mempertahankan kualitas semen setelah pembekuan dan dapat digunakan untuk program inseminasi buatan (IB). Hasil penelitian menyimpulkan pengencer TNL 10 mg/mL menghasilkan respons yang lebih stabil dan homogen, menunjukkan performa krioprotektif yang sebanding dengan pengencer TKT. Keunggulan tambahan berupa kejernihan, biosekuriti yang lebih baik, dan standarisasi komposisi. Karakteristik dari TNL sebagai alternatif pengencer yang layak dan berkelanjutan untuk kriopreservasi semen sapi serta mendukung potensinya untuk penerapan yang lebih luas dalam program pembibitan ternak sapi di Indonesia.