Kajian Proteomik Sperma Sebagai Penentu Biomarker Molekuler Kualitas Semen Pada Sapi Pesisir.

Abstract

Indonesia memiliki keragaman sumber daya genetik yang sangat beragam, salah satunya adalah sapi pesisir. Sapi pesisir merupakan plasma nutfah unggulan termasuk dalam kelompok sapi potong lokal dengan populasi utama di Sumatera Barat. Sapi ini secara morfologis, memiliki ciri khas berupa warna tubuh kuning hingga merah bata, ukuran tubuh yang relatif kecil, serta bertanduk pendek. Postur tubuhnya yang kecil menjadikannya pilihan favorit peternak karena harga yang lebih terjangkau. Sapi ini memiliki kemampuan adaptasi tinggi terhadap kondisi kering tropis, ketahanan terhadap penyakit, serta kesesuaiannya dengan sistem pemeliharaan tradisional. Sapi pesisir, selain nilai genetiknya, juga memiliki makna sosial dan budaya yang kuat bagi masyarakat setempat. Upaya peningkatan mutu genetik dilakukan melalui penerapan bioteknologi modern, termasuk penggunaan teknologi omik, khususnya proteomik, guna mendukung pengembangan serta menjaga keberlanjutan sapi pesisir sebagai salah satu rumpun lokal unggulan. Tujuan dari penelitian ini secara umum adalah untuk mengidentifikasi penanda biologis yang berhubungan dengan fungsi reproduksi pada sapi pesisir melalui pendekatan molekuler berbasis proteomik. Tujuan khusus, 1) Mengkaji karakteristik semen sapi pesisir secara kualitatif dan kuantitatif untuk memperoleh gambaran umum mengenai kualitas reproduksi, 2) Menganalisis profil protein pada sperma dan plasma semen menggunakan metode 1D SDS-PAGE untuk mengidentifikasi pola ekspresi dan variasi pita protein antar individu pejantan, 3) Mengidentifikasi berbagai jenis protein yang diekspresikan melalui analisis proteomik berbasis LC-MS/MS serta menetapkan protein-protein yang berpotensi berperan dalam fungsi reproduksi, 4). Menemukan kandidat biomarker reproduksi pada sapi pesisir guna mendukung program seleksi pejantan unggul dalam pelestarian dan peningkatan kualitas plasma nutfah lokal. Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat mengungkap protein kandidat yang berpotensi menjadi biomarka fungsi reproduksi pada sapi pesisir. Sebanyak 12 ekor sapi pesisir jantan berumur kurang dari 2 hingga 4 tahun digunakan sebagai objek penelitian. Setiap individu diberi kode identifikasi P1 sampai P12 berdasarkan urutan pengambilan sampel, dengan P1 sebagai urutan pertama dan P12 sebagai urutan terakhir. Sepuluh ekor berasal dari Balai Pembibitan Ternak Unggul dan Hijauan Pakan Ternak (BPTU-HPT) Padang Mangatas dan 2 ekor dari Balai Inseminasi Buatan Daerah (BIBD) Tuah Sakato. Proses penampungan semen dilakukan oleh dokter hewan terlatih menggunakan elektroejakulator. Probe dilumasi gel dan dimasukkan secara hati-hati ke dalam rectum. Rangsangan diberikan secara bertahap secara automatik. Rangsangan dihentikan jika telah terjadi ejakulasi. Semen yang diperoleh segera dibawa ke laboratorium untuk dievaluasi. Evaluasi semen meliputi pemeriksaan makroskopis dan mikroskopis. Motilitas sperma dan konsentrasi sperma dilakukan menggunakan Computer Assisted Semen Analysis (CASA) portable (AndroScope, Minitube, Germany). Semen disentrifuge dengan kecepatan 6000 RPM, supernatant dan pellet dipisahkan dan disimpan pada suhu -20oC. Konsentrasi protein ditentukan menggunakan metode bicinchoninic acid assay (BCA) sebelum analisis 1D SDS-PAGE dilakukan. Profil protein dianalisis melalui 1D SDS-PAGE menggunakan gel gradien 4%–20% dan marker Protein Marker PM2700/3-Color Broad Range (rentang 10–270 kDa). Analisis proteomik selanjutnya dilakukan melalui in gel digestion untuk dilakukan analisis proteomik melalui metode LC-MS/MS, dan data dianotasi menggunakan perangkat bioinformatik Venny, UniProt, PANTHER, DAVID, dan STRING. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kualitas semen segar sapi pesisir bervariasi antar pejantan. Rerata motilitas total 84,77 ± 26,88%, dengan motilitas progresif 74,81%. serta nilai ALH sebesar 3,76 ± 0,94 µm/s, mengindikasikan bahwa sebagian pejantan memiliki kemampuan pergerakan sperma yang tergolong baik. Tiga individu (P3, P4, dan P6) dengan umur <2 tahun memperlihatkan kualitas semen yang lebih unggul. Pejantan berumur 2–3 tahun (P1) menunjukkan performa semen yang relatif lebih rendah, sedangkan pejantan berumur 4 tahun memiliki kualitas semen terbaik dibandingkan dengan seluruh sampel yang dikoleksi. Analisis protein menggunakan metode 1D SDS-PAGE terdapat total 14 pita protein sperma berhasil diidentifikasi dengan kisaran berat molekul (BM) 10–150 kDa. Terdeteksi 12 pita protein pada plasma semen dengan rentang BM 14–270 kDa. Pita protein sperma berukuran rendah BM 10–20 kDa muncul konsisten pada seluruh kelompok umur, sementara pita protein plasma semen berukuran BM 14–34 kDa juga terekspresi secara konsisten di semua kelompok umur. Hasil ini berkaitan dengan keseragam pada seluruh calon pejantan sapi Pesisir, sehingga tidak ditemukan adanya protein yang bersifat spesifik individu. Pita protein ini berkaitan dengan keseluruhan parameter kualitas semen dan dapat dipertimbangkan sebagai marker umum kualitas semen berbasis protein fungsional semen sapi pesisir. Protein yang terekpersi memberikan dasar ilmiah yang kuat dalam pengembangan biomarker molekuler potensial dalam seleksi pejantan unggul serta mendukung peningkatan program pemuliaan sapi Pesisir. Analisis proteomik berhasil mengidentifikasi 334 protein dalam sperma sapi pesisir, yang terbagi atas 8 protein spesifik terekspresi di umur <2 tahun, 70 protein spesifik terekspresi di umur 2-3 tahun dan 6 protein spesifik terekspresi di umur 4 tahun, dan yang lain diekspresikan di antara semua kelompok umur pejantan. Analisis keseluruan total protein mengidentifikasi dua protein utama, yaitu ZPBP dan SPACA3, yang berperan dalam proses reproduksi, terutama terkait protein fungsional reaksi akrosom selama proses fertilisasi. Analisis Gene Ontologi menunjukkan sebagian besar protein sperma berperan dalam berbagai proses biologis, yang termasuk aktivitas seluler, proses metabolisme, dan fungsi molekuler yang berkaitan dengan aktivitas katalitik. Kesimpulannya, Kualitas semen segar sapi pesisir memperlihatkan keragaman antar calon pejantan yang dipengaruhi oleh kondisi fisiologi reproduksi masing-masing individu, pejantan umur empat tahun memiliki kualitas semen yang paling optimal. Analisis proteomik berhasil mengidentifikasi protein ZPBP dan SPACA3 berkaitan dengan protein fungsional fertilisasi. Kedua protein ini ditetapkan sebagai biomarker molekuler yang berkaitan dengan reproduksi fungsi fertilitas pada sapi Pesisir.

Indonesia harbors a remarkably diverse range of genetic resources, including the Pesisir cattle, a valuable indigenous germplasm classified as a local beef breed with the main population found in West Sumatra. This breed is morphologically characterized by its yellow to brick-red coat color, relatively small body size, and short horns. Its compact stature makes it a preferred choice among farmers for disease resistance and compatibility with traditional husbandry systems. Beyond its genetic value, Pesisir cattle also hold significant social and cultural importance for local communities. To support the development and ensure the sustainability of this prominent local breed, efforts to improve its genetic quality are essential, particularly through the adoption of modern biotechnological approaches, including omics-based methods such as proteomic analysis. The objective of this study was to identify biological markers associated with reproductive function in Pesisir bull using a proteomics-based molecular approach. Specifically, the study aimed to: (1) evaluate the qualitative and quantitative characteristics of Pesisir bulls semen to obtain an overall assessment of reproductive quality; (2) analyze protein profiles in sperm and seminal plasma using 1D SDS-PAGE to identify early expression patterns and inter-individual variation in protein banding; (3) identify the expressed protein types through LC-MS/MS based proteomic analysis and determine proteins potentially involved in sperm motility, viability, and fertility, and (4) discover candidate reproductive biomarkers in Pesisir Bull to support superior sire selection programs for the preservation and genetic improvement of local germplasm. The findings of this study are expected to reveal candidate proteins with potential as biomarkers of reproductive function in Pesisir Bull. This study used a total of 12 Pesisir bulls, aged two to four years, consisting of ten animals obtained from the BPTUHPT Padang Mangatas and two from the BIBD Tua Sakato. A trained veterinarian performed semen collection using an electro-ejaculator. A lubricated probe was carefully inserted into the rectum, and electrical stimulation was gradually applied. Semen evaluation included both macroscopic and microscopic examinations, while sperm kinematics and concentration were assessed using a Portable Computer Assisted Semen Analysis (CASA; Androscope, Minitube, Germany). Protein concentration was measured using the bicinchoninic acid (BCA) assay, whereas protein profiling was carried out through 1D SDS-PAGE using 4%–20% gradient gels and a PM2700/3-Color Broad Range Protein Marker (10–270 kDa). Subsequent proteomic analysis was conducted via in-gel digestion followed by LC-MS/MS, and the resulting data were annotated using bioinformatics tools including UniProt, PANTHER, DAVID, and STRING. The results showed that the fresh semen quality of Pesisir cattle fell within the acceptable range for use in artificial insemination programs. The mean total motility was 84.77 ± 26.88%, with progressive motility reaching 74.81%, and an ALH value of 3.76 ± 0.94 µm/s, indicating that sperm exhibited good motility performance. Among the six bulls under two years of age, three individuals (P3, P4, and P6) displayed superior semen quality. The bull aged 2–3 years (P1) demonstrated comparatively lower semen performance, whereas the 4-year-old bull showed the highest semen quality among all samples evaluated. Protein analysis using the 1D SDS-PAGE method identified a total of 14 sperm protein bands with molecular weights (MW) ranging from 10 to 150 kDa. In seminal plasma, 12 protein bands were detected within an MW range of 14–270 kDa. Low-molecular-weight sperm protein bands (10–20 kDa) were consistently observed across all age groups, while seminal plasma protein bands with MWs of 14–34 kDa were also uniformly expressed in all age groups. These findings indicate a high degree of similarity among all prospective Pesisir bull sires, with no individual-specific proteins being detected. The identified protein bands were associated with overall semen quality parameters and may therefore be considered general biomarkers of semen quality based on functional semen proteins in Pesisir bulls. The expressed proteins provide a strong scientific basis for the development of potential molecular biomarkers for superior sire selection and support the improvement of Pesisir cattle breeding programs. Proteomic analysis successfully identified 334 proteins in Pesisir bull spermatozoa, comprising 8 specifically expressed proteins in bulls aged <2 years, 70 specifically expressed proteins in bulls aged 2–3 years, and 6 specifically expressed proteins in bulls aged 4 years, while the remaining proteins were expressed across all sire age groups. Comprehensive protein analysis identified two major proteins, namely ZPBP and SPACA3, which are involved in reproductive processes, particularly as functional proteins associated with the acrosome reaction during fertilization. Gene Ontology analysis revealed that the majority of sperm proteins were involved in diverse biological processes, including cellular activity, metabolic processes, and molecular functions related to catalytic activity. In conclusion, the fresh semen quality of Pesisir bulls exhibited variation among prospective sires, influenced by the reproductive physiological condition of each individual, with four year old bulls demonstrating the most optimal semen quality. Proteomic analysis successfully identified the ZPBP and SPACA3 proteins as being associated with fertilization related functions. These proteins are proposed as molecular biomarkers associated with fertility function in Pesisir bulls.