GENOM Aureobasidium melanogenum DAN Pseudozyma hubeiensis SERTA PERANNYA DALAM DEKONTAMINASI AFLATOKSIN B1 DAN PENGENDALIAN Aspergillus flavus PADA BIJI PALA

Abstract

Pala (Myristica fragrans) yang termasuk ke dalam famili Myristicaceae merupakan tanaman asli Indonesia dan termasuk komoditas rempah ekspor unggulan. Pala tidak hanya digunakan sebagai bumbu masakan, tetapi juga dimanfaatkan dalam bidang kesehatan dan farmasi. Pala mengandung berbagai senyawa bioaktif termasuk minyak atsiri (seperti sabinen, miristisin, safrol, a-pinene), senyawa fenolik, alkaloid dan flavonoid. Kontaminasi aflatoksin oleh Aspergillus flavus dapat memengaruhi kualitas ekspor biji pala Indonesia. Penelitian ini bertujuan mengisolasi dan menyeleksi khamir yang berpotensi mendekontaminasi aflatoksin B1 (AFB1) serta mengendalikan pertumbuhan A. flavus, menganalisis sekuen genom total (whole genome sequencing) dari isolat khamir terpilih untuk memperoleh informasi genetik yang terlibat dalam mekanisme dekontaminasi AFB1 dan pengendalian A. flavus serta mengetahui potensi khamir terpilih dalam mengendalikan A. flavus dan mereduksi AFB1 secara in vivo pada biji pala.

Sebanyak 11 isolat khamir berhasil diisolasi dari pala (8 isolat dari daun dan 3 isolat dari buah dan biji pala). Berdasarkan uji aktivitas hemolitik, seluruh khamir yang diisolasi bersifat non patogen. Selanjutnya, dilakukan seleksi untuk mengetahui kemampuan khamir tumbuh pada media yang mengandung AFB1 dengan konsentrasi 0, 100 dan 200 ppb. Hasil yang diperoleh yaitu isolat DAP1 asal daun pala memiliki nilai optical density (OD) yang paling tinggi dan konstan pada media yang mengandung AFB1 0, 100 dan 200 ppb serta isolat BUP asal buah pala memiliki nilai OD yang hampir sama. Untuk itu, isolat DAP1 dan BUP dipilih untuk uji dekontaminasi AFB1 menggunakan analisis HPLC. Hasil uji dekontaminasi menunjukkan bahwa isolat DAP1 dan BUP mampu menurunkan AFB1 masing-masing sebesar 50,4 dan 53,03%. Selain mampu mendekontaminasi AFB1, kedua isolat juga mampu menghambat pertumbuhan A. flavus masing-masing sebesar 43,6 dan 46,1% secara dual culture. Identifikasi molekuler berdasarkan analisis ITS, isolat DAP1 diidentifikasi sebagai Aureobasidium melanogenum dan BUP sebagai Pseudozyma hubeiensis.

Hasil perakitan genom A. melanogenum DAP1 memiliki ukuran sebesar 24,06 Mb dengan kandungan GC sebesar 50,14%. Anotasi genom A. melanogenum DAP1 berdasarkan kategori Cluster Ortolog Grup (COG) didominasi oleh gen-gen dengan fungsi yang belum diketahui (S), transpor dan metabolisme karbohidrat (G), modifikasi pascatranslasi, pergantian protein dan chaperone (O), transpor dan metabolisme asam amino (E), serta transpor intraseluler, sekresi, dan transpor vesikular (U). Anotasi genom A. melanogenum DAP1 berdasarkan basis data Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) menggunakan BlastKOALA menunjukkan bahwa sebagian besar gen diklasifikasikan menjadi pemrosesan informasi genetik (796 gen), famili protein yang terkait dengan pemrosesan informasi genetik (732 gen), metabolisme karbohidrat (316 gen), famili protein yang terkait dengan pensinyalan dan proses seluler (288 gen), proses seluler (252 gen), dan metabolisme asam amino (170 gen).

Untuk genom P. hubeiensis BUP diperoleh ukuran sebesar 18,65 Mb dengan kandungan GC sebesar 56,4%. Anotasi gen berdasarkan kategori COG dari genom P. hubeiensis BUP didominasi oleh gen-gen dengan fungsi belum diketahui (S), modifikasi pascatranslasi, pergantian protein, chaperone (O), pergerakan intraseluler, sekresi, transportasi vesikular (U), dan translasi, struktur ribosom, dan biogenesis (J). Anotasi fungsional menggunakan BlastKOALA berdasarkan basis data KEGG mengungkapkan bahwa pada genom P. hubeiensis BUP mencakup pemrosesan informasi genetik (477 gen), famili protein yang terkait dengan pemrosesan informasi genetik (423 gen), metabolisme karbohidrat (175 gen), famili protein yang terkait dengan pensinyalan dan proses seluler (147 gen), proses seluler (146 gen), metabolisme asam amino (97 gen), dan pemrosesan informasi lingkungan (91 gen).

Analisis whole genome sequencing dari A. melanogenum DAP1 dan P. hubeiensis BUP menunjukkan adanya sejumlah gen yang berperan dalam dekontaminasi AFB1 di antaranya yaitu cytochrome P450 monooxygenase (CYP619, CYP504A, CYP505), glutathione transferase (GST), epoxide hydrolase (EPHX1), aflatoksin B1 aldehyde reductase (AKR7) dan SNQ2/ABC transporter & QDR1_2 / MFS transporter. Analisis AntiSMASH terhadap genom A. melanogenum DAP1 mengungkapkan adanya Biosynthetic Gene Clusters (BGCs) / klaster gen biosintetik yang memiliki kemiripan tinggi dengan metabolit bioaktif yang telah diketahui, di antaranya yaitu scytalone/T3HN (40%), burnettramic acid A (33%), yanuthone (50%), lucilactaene (46%), heptelidic acid (36%), betalactone, NRPS yang mirip metachelin C/metachelin A/metachelin ACE/ metachelin B/dimerumic (25%) dan choline (100%). Analisis genom P. hubeiensis BUP memiliki klaster gen biosintetik yang menunjukkan kemiripan dengan clavaric acid (100%), choline (100%) dan ustilagic acid (8%).

Berdasarkan uji kemampuan kolonisasi A. melanogenum DAP1 dan P. hubeiensis BUP menunjukkan bahwa kedua isolat mampu mengkolonisasi permukaan biji pala. Isolat DAP1 mengkolonisasi biji pala dan mencapai puncak maksimal pada hari ke-9 yaitu sebesar 6,5 log10 CFU/biji sedangkan P. hubeiensis BUP maksimal mengkolonisasi biji pala pada inkubasi hari ke-6 yaitu sebesar 6,3 log10 CFU/biji. Uji in vivo A. melanogenum DAP1 dan P. hubeiensis BUP dalam menghambat A. flavus pada biji pala masing-masing sebesar 58,3 dan 98,4% pada inkubasi hari ke-15. Analisis LC–MS/MS menunjukkan bahwa kadar AFB1 dalam biji pala yang diberi perlakuan isolat A. melanogenum DAP1 dan P. hubeiensis BUP terdeteksi masing-masing kurang dari 1,26 ppb dibandingkan dengan kontrol yaitu biji pala yang tidak diberi perlakuan isolat DAP1 dan BUP memiliki kandungan AFB1 sebesar 20,03 ppb.

Uraian hasil penelitian yang diperoleh menunjukkan beberapa kebaruan yaitu (1) diperolehnya isolat khamir asal pala yang memiliki kemampuan mendekontaminasi AFB1 dan mengendalikan A. flavus yaitu Aureobasidium melanogenum DAP1 dan Pseudozyma hubeiensis BUP (2) diperolehnya data mengenai karakter fungsional dan fitur genom A. melanogenum DAP1 dan P. hubeiensis BUP yang di duga berperan dalam proses dekontaminasi AFB1 dan pengendali A. flavus, (3) diperolehnya informasi mengenai kemampuan A. melanogenum DAP1 dan P. hubeiensis BUP dalam mengendalikan A. flavus dan mereduksi AFB1 secara in vivo pada biji pala.

Nutmeg (Myristica fragrans), belonging to the family Myristicaceae, is native to Indonesia and is one of the country’s leading export spice commodities. Nutmeg is not only used as a culinary spice but is also widely utilized in the health and pharmaceutical industries. It contains various bioactive compounds, including essential oils (such as sabinene, myristicin, safrole, and a-pinene), phenolic compounds, alkaloids, and flavonoids. However, contamination by aflatoxin produced by Aspergillus flavus can significantly affect the export quality of Indonesian nutmeg seeds. This study aimed to isolate and select yeast strains with the potential to detoxify aflatoxin B1 (AFB1) and inhibit the growth of A. flavus, to analyze the whole genome sequences of selected yeast isolates to obtain information on genes presumed to be involved in AFB1 detoxification mechanisms and A. flavus control, and to evaluate the potential of the selected yeasts to control A. flavus and reduce AFB1 in vivo in nutmeg seeds.

A total of 11 yeast isolates were successfully obtained from nutmeg (eight isolates from leaves and three isolates from fruit and seeds). Based on hemolytic activity tests, all isolated yeasts were non-pathogenic. Screening was then conducted to determine the ability of the yeasts to grow in media containing AFB1 at concentrations of 200 ppb, 100 ppb, and 0 ppb. The results showed that isolate DAP1 from nutmeg leaves and isolate BUP from nutmeg fruit exhibited the highest and most stable optical density values (2.5) in media containing 0, 100 and 200 ppb AFB1. Therefore, isolates DAP1 and BUP were selected for AFB1 detoxification testing using HPLC analysis. The detoxification results indicated that isolates DAP1 and BUP reduced AFB1 levels by 50.4 and 53.03%, respectively. In addition to detoxifying AFB1, both isolates inhibited the growth of A. flavus by 43.6 and 46.1%, respectively, in dual culture assays. Molecular identification based on ITS analysis identified isolate DAP1 as Aureobasidium melanogenum and BUP as Pseudozyma hubeiensis.

The genome assembly of A. melanogenum DAP1 had a size of 24.06 Mb with a GC content of 50.14%. Genome annotation based on Cluster of Orthologous Groups (COG) categories was dominated by genes with unknown function (S), carbohydrate transport and metabolism (G), post-translational modification, protein turnover, and chaperones (O), amino acid transport and metabolism (E), and intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport (U). KEGG-based genome annotation using BlastKOALA showed that most genes were classified into genetic information processing (796 genes), protein families related to genetic information processing (732 genes), carbohydrate metabolism (316 genes), protein families related to signaling and cellular processes (288 genes), cellular processes (252 genes), and amino acid metabolism (170 genes).

The genome of P. hubeiensis BUP had a size of 18.65 Mb with a GC content of 56.4%. COG-based annotation indicated genes mainly associated with unknown function (S), post-translational modification, protein turnover, chaperones (O), intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport (U), and translation, ribosomal structure, and biogenesis (J). Functional annotation using BlastKOALA against the KEGG database revealed categories including genetic information processing (477 genes), protein families related to genetic information processing (423 genes), carbohydrate metabolism (175 genes), protein families related to signaling and cellular processes (147 genes), cellular processes (146 genes), amino acid metabolism (97 genes), and environmental information processing (91 genes).

Whole genome sequencing analysis of A. melanogenum DAP1 and P. hubeiensis BUP revealed several genes presumed to be involved in AFB1 reduction, including cytochrome P450 monooxygenase (CYP619, CYP504A, CYP505), glutathione transferase (GST), epoxide hydrolase (EPHX1), aflatoxin B1 aldehyde reductase (AKR7), and SNQ2/ABC transporter and QDR1_2/MFS transporter. AntiSMASH analysis of the A. melanogenum DAP1 genome revealed biosynthetic gene clusters showing similarity to known bioactive metabolites, including scytalone/T3HN (40%), burnettramic acid A (33%), yanuthone (50%), lucilactaene (46%), heptelidic acid (36%), betalactone, NRPS similar to metachelin C/metachelin A/metachelin A-CE/metachelin B/dimerumic (25%), and choline (100%). Meanwhile, the P. hubeiensis BUP genome contained biosynthetic clusters similar to clavaric acid (100%), choline (100%), and ustilagic acid (8%).

Colonization assays showed that both A. melanogenum DAP1 and P. hubeiensis BUP were able to colonize the surface of nutmeg seeds. Isolate DAP1 reached its maximum population on day 9 (6.5 log10 CFU/seed), while P. hubeiensis BUP reached its maximum colonization on day 6 (6.3 log10 CFU/seed). In vivo assays demonstrated that A. melanogenum DAP1 and P. hubeiensis BUP inhibited A. flavus growth in nutmeg seeds by 58.3 and 98.4%, respectively, after 15 days of incubation. LC–MS/MS analysis showed that AFB1 levels in nutmeg seeds treated with A. melanogenum DAP1 and P. hubeiensis BUP were less than 1.26 ppb, compared to untreated seeds, which contained 20.03 ppb AFB1.

The findings of this study present several novelties: (1) the isolation of nutmegderived yeast strains capable of detoxifying AFB1 and controlling A. flavus, namely Aureobasidium melanogenum DAP1 and Pseudozyma hubeiensis BUP; (2) the acquisition of functional and genomic feature data of A. melanogenum DAP1 and P. hubeiensis BUP presumed to be involved in AFB1 detoxification and A. flavus control; and (3) evidence of the in vivo ability of these yeasts to control A. flavus and reduce AFB1 in nutmeg seeds.