Karakterisasi Bakteri Penghasil Asam Asetat dari Madu Lebah Heterotrigona itama dan Apis cerana Asal Sukabumi

Abstract

Madu merupakan produk alami dengan profil rasa yang bergantung pada sumber nektar serta jenis lebahnya. Lebah dari subfamili Meliponinae, menghasilkan madu dengan rasa asam, sedangkan lebah dari subfamili Apinae, menghasilkan madu yang manis. Madu mengandung banyak nutrisi dan menjadi habitat bagi berbagai bakteri yang berasal dari nektar dan saluran pencernaan lebah. Bakteri penghasil asam laktat merupakan kelompok bakteri yang berasosiasi dengan madu. Bakteri penghasil asam laktat termasuk ke dalam bakteri fermentatif yang memanfaatkan kandungan gula dalam madu untuk menghasilkan asam laktat. Selain itu, terdapat kelompok bakteri penghasil asam asetat yang turut menghasilkan asam organik dan diduga berkontribusi terhadap karakteristik madu. Bakteri penghasil asam asetat memiliki kemampuan mengoksidasi etanol serta glukosa menjadi asam asetat. Bakteri ini umumnya diidentifikasi dari famili Acetobacteraceae. Selain itu, beberapa bakteri dari famili Enterobacteriaceae juga diketahui dapat memproduksi asam asetat. Bakteri penghasil asam asetat telah ditemukan di saluran pencernaan lebah tanpa sengat, namun keberadaannya dalam madu di Indonesia belum dilaporkan. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk: (1) mengkaji karakteristik madu yang diduga berkaitan dengan keberadaan bakteri penghasil asam organik, (2) mengeksplorasi bakteri penghasil asam laktat dan asam asetat pada madu lebah Heterotrigona itama dan Apis cerana asal Sukabumi, (3) mengkarakterisasi bakteri penghasil asam asetat. Penelitian ini menggunakan sampel madu dari spesies lebah H. itama dan A. cerana yang diperoleh dari peternak lebah di Desa Cijangkar, Kecamatan Nyalindung, Kabupaten Sukabumi. Pengambilan sampel dari tiga koloni lebah H. itama (Hi1, Hi2, dan Hi3) dan tiga koloni lebah A. cerana (Ac1, Ac2, dan Ac3) dilakukan secara aseptik menggunakan peralatan steril. Parameter fisikokimia madu yang diukur meliputi Electrical Conductivity (EC), Total Dissolved Solids (TDS), pH, kadar air, serta suhu madu di lokasi pengambilan sampel dengan menggunakan instrumen yang telah terkalibrasi. Penentuan kadar gula pereduksi dan gula total menggunakan spektrofotometri. Bakteri penghasil asam laktat dan asam asetat diisolasi dari semua sampel madu. Koloni tunggal yang menghasilkan zona bening dan zona kuning dihitung menggunakan Total Plate Count (TPC). Isolat bakteri penghasil asam asetat dikarakterisasi secara makroskopis dan mikroskopis. Seluruh isolat yang diperoleh diseleksi berdasarkan nilai indeks potensial zona kuning dan total asam tertitrasi untuk mengevaluasi kapasitas produksi asam asetatnya. Uji patogenitas dilakukan menggunakan media agar-agar darah. Isolat terbaik digunakan dalam tahap optimasi media produksi yang berbeda. Kemampuan isolat pada media optimum dianalisis lebih lanjut melalui kurva pertumbuhan yang mencakup parameter jumlah koloni, fluktuasi pH, dan konsentrasi asam asetat. Identifikasi molekuler dilakukan berdasarkan sekuens gen 16S rRNA dan dianalisis melalui konstruksi pohon filogenetik. Seluruh data dianalisis menggunakan Analysis of Variance (ANOVA). Hasil penelitian menunjukkan bahwa kualitas madu berdasarkan nilai EC, TDS, dan kadar air pada madu lebah H. itama lebih tinggi, sedangkan nilai pH lebih rendah dibandingkan dengan madu lebah A. cerana. Namun, madu lebah A. cerana memiliki suhu yang lebih tinggi di antara semua sampel madu, yaitu sebesar 30,9 °C (p < 0,05). Selain itu, madu lebah H. itama memiliki kadar gula pereduksi dan gula total yang lebih rendah dibandingkan dengan madu lebah A. cerana. Sampel Hi1 menunjukkan kadar gula pereduksi dan gula total paling rendah berturut-turut sebesar 24,31 dan 32,76 g/100 g. Perbedaan karakteristik madu antara lebah H. itama dan A. cerana diduga berkaitan dengan keberadaan bakteri penghasil asam laktat dan asam asetat. Madu lebah H. itama mengandung bakteri penghasil asam laktat pada sampel Hi1, Hi2, dan Hi3 yang berturut-turut adalah 39,7; 0,8; dan 0,7 × 10¹ CFU/mL, serta bakteri penghasil asam asetat pada sampel yang sama dengan jumlah 6,1; 2,3; dan 1,3 × 10¹ CFU/mL. Keberadaan kedua kelompok bakteri penghasil asam organik tersebut diduga berkontribusi terhadap karakteristik madu dan pembentukan rasa asam pada madu lebah H. itama. Sementara itu, madu lebah A. cerana hanya mengandung bakteri penghasil asam laktat pada sampel Ac1, Ac2, dan Ac3 yang berturut-turut adalah 2,8; 0,7; dan 0,7 × 10¹ CFU/mL. Isolat bakteri penghasil asam asetat dari madu lebah H. itama diuji lebih lanjut sebanyak 11 isolat. Secara makroskopis, isolat bakteri penghasil asam asetat menunjukkan karakteristik yang seragam. Namun, secara mikroskopis, bentuk sel bervariasi antara basil (Hi11 dan Hi113) dan kokus (isolat lainnya). Isolat Hi2 termasuk bakteri Gram-positif, sedangkan isolat lainnya tergolong bakteri Gram-negatif. Seluruh isolat juga diklasifikasikan sebagai nonpatogen (gamma-hemolisis) dan memiliki karakteristik produksi asam asetat yang berbeda-beda. Namun, isolat Hi11 menghasilkan asam asetat tertinggi dibandingkan dengan isolat lainnya berdasarkan nilai indeks potensial zona kuning dan produksi asam asetat yang berturut-turut sebesar 0,803 cm dan 0,300%. Optimasi media berbeda terhadap isolat Hi11 menunjukkan bahwa media Glucose Yeast extract Peptone Ethanol (GYPE1) merupakan media paling optimal. Media ini mendukung produksi asam asetat sebesar 0,295% atau setara dengan 1,450 mEq/100 mL (sebagai asam asetat). Media terpilih tersebut selanjutnya digunakan untuk analisis kurva pertumbuhan. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa pada jam ke-35 terjadi penurunan jumlah koloni isolat Hi11 menjadi 4,86 Log CFU/mL dan diikuti oleh penurunan pH hingga mencapai 3,0, yang berkorelasi dengan produksi asam asetat tertinggi sebesar 0,27%. Berdasarkan identifikasi molekuler sekuens gen 16S rRNA, isolat Hi11 memiliki kekerabatan dekat dengan beberapa strain Enterobacter ludwigii. Isolat tersebut diidentifikasi hingga tingkat genus sebagai Enterobacter dengan nilai bootstrap 79. Sementara itu, isolat Hi2 dikonfirmasi sebagai Staphylococcus saprophyticus dengan nilai bootstrap 100. Bakteri yang ditemukan termasuk kelompok oportunistik, namun tidak selalu bersifat patogen. Salah satu contohnya adalah Klebsiella pneumoniae yang dilaporkan berperan dalam produksi vitamin B12 pada tempe.