Species Responses, Jasmonate-Induced Resistance to Soft-Rot Disease, and NAC29-Based Diversity Analysis in Phalaenopsis

Abstract

Phalaenopsis orchids are among the most coveted commodities in the global floriculture industry due to their long-lasting flowers and distinctive ornamental traits. However, optimal cultivation of Phalaenopsis, especially during its long vegetative phase, requires high temperature and relative humidity, conditions that also favor the development of disease pathogens. One of the most devastating diseases affecting Phalaenopsis is soft rot disease (SRD), which is mainly caused by necrotrophic bacteria of the Pectobacterium and Dickeya genera. SRD can lead to rapid disease progression and total crop loss, with inoculum spreading easily among plants. Current control measures rely primarily on chemical bactericides or roguing of infected plants, but these approaches are often ineffective and raise environmental concerns. Consequently, breeding Phalaenopsis varieties resistant to SRD through conventional and biotechnological approaches represents a sustainable alternative; however, limited information was available regarding potential SRD-resistant donors and the mechanism of soft-rot resistance in Phalaenopsis. Hence, in this research, we aimed to screen for SRD resistance in Phalaenopsis species found in Indonesia to enrich the breeding pipeline, determine the optimal methyl jasmonate (MeJA) concentration to induce SRD resistance in Phalaenopsis, and develop molecular markers to aid the breeding program in producing SRD-resistant Phalaenopsis varieties. In this study, screening efforts successfully identified three additional SRD- resistant species- P. corningiana, P. modesta, and P. tetraspis- in addition to the previously reported P. amboinensis. Despite up to 92 species having been identified in the Phalaenopsis genus, only 18 species have been widely utilized in breeding programs, and the newly identified resistant species remain underexploited, suggesting their potential to enrich breeding pipelines for developing SRD-resistant cultivars. To support resistance breeding, this study also examined the role of pre- existing defense mechanisms by analyzing leaf anatomical and epidermal traits; however, no significant correlation was found between these structural traits and SRD resistance, suggesting that constitutive physical defenses may play a limited role in post-infection SRD-resistance in Phalaenopsis. Given the importance of induced defenses against necrotrophic pathogens, the role of the jasmonic acid/ethylene (JA/ET) was further investigated. Exogenous application of MeJA significantly reduced SRD symptom development in susceptible Phalaenopsis genotypes namely P. amabilis ‘Jawa Barat’ and P. pulcherrima ‘Aceh’, although the magnitude of induced resistance varied among genotypes. While 1 mM concentrations of MeJA enhanced resistance, higher concentrations (up to 10 mM) failed to induce resistance and instead triggered leaf senescence in P. pulcherrima ‘Aceh’. These findings underscore the importance of the jasmonate pathway in SRD resistance in Phalaenopsis. Hence, a future study is necessary to elucidate the SRD-induced resistance mechanism, in which MeJA induces Phalaenopsis SRD resistance, especially through the regulation of terpenoids. To facilitate marker-assisted breeding, this study also explored the development of molecular markers from the open reading frame (ORF) of differentially expressed NAC29 transcription factor gene. Sequence analysis of NAC29 across ten Phalaenopsis species revealed SNP and indel variation present throughout the ORF. High conservation was observed in the NAC domain, while the transcriptional activation region was highly variable. No mutation was uniquely associated with SRD resistance. Five SNAP markers were developed from biallelic SNPs to analyze genetic diversity at the subgenus level. Four of the five primers have moderate marker polymorphic information content; however, two of these markers have high null allele frequency. Using only five primers was insufficient to differentiate species within different subgenera clearly. Overall, the results highlight the complexity of SRD resistance in Phalaenopsis and underscore the need for further functional and genomic studies to enable effective resistance- breeding strategies.

Anggrek Phalaenopsis merupakan salah satu komoditas florikultura utama global karena bunganya yang tahan lama dan memiliki karakter bunga yang menarik. Salah satu kendala utama budidaya Phalaenopsis adalah tingginya prevalensi hama dan penyakit selama fase vegetatif yang memerlukan suhu dan kelembaban relatif yang tinggi. Penyakit busuk lunak (PBL) yang disebabkan oleh bakteri nektrotropik dari genus Pectobacterium dan Dickeya merupakan salah satu penyakit utama anggrek Phalaenopsis. PBL dapat memiliki perkembangan penyakit yang cepat dan berpotensi menyebabkan kehilangan total karena inokulum mudah menyebar antar tanaman tanaman. Tindakan pengendalian PBL saat ini utamanya dilakukan menggunakan bakterisida berbahan aktif tembaga atau roguing tanaman terinfeksi, tetapi pendekatan ini seringkali tidak efektif dan berpotensi menyebabkan pencemaran lingkungan. Oleh karena itu, pemuliaan varietas Phalaenopsis yang tahan terhadap PBL melalui pendekatan konvensional dan bioteknologi merupakan alternatif yang berkelanjutan. Namun, informasi yang tersedia mengenai potensi donor tahan SRD dan mekanisme ketahanan terhadap busuk lunak pada Phalaenopsis masih terbatas. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan mengidentifikasi alternatif spesies Phalaenopsis yang resisten terhadap PBL sebagai calon yang ditemukan di Indonesia untuk memperkaya jalur pemuliaan, menentukan konsentrasi metil jasmonat (MeJA) optimal untuk menginduksi resistensi SRD pada Phalaenopsis, dan mengembangkan penanda molekuler untuk membantu program pemuliaan dalam menghasilkan varietas Phalaenopsis yang resisten terhadap SRD. Dalam penelitian ini, penapisan ketahanan PBL berhasil mengidentifikasi tiga spesies resisten PBL tambahan-P. corningiana, P. modesta, dan P. tetraspis- selain P. amboinensis yang telah dilaporkan sebelumnya. Meskipun terdapat 92 spesies yang teridentifikasi dari genus Phalaenopsis, hanya 18 spesies yang telah banyak digunakan dalam program pemuliaan, dan spesies resisten yang baru teridentifikasi belum banyak digunakan, menunjukkan potensinya untuk memperkaya keragaman tetua dalam pengembangan varietas Phalaenopsis resisten SRD. Selain identifikasi tetua resisten PBL yang potensial, elusidasi peran mekanisme pertahanan fisik konstitutif juga dilakukan melalui analisis karakter anatomi dan epidermis daun. Namun, tidak ditemukan korelasi signifikan antara karakter tersebut dan resistensi PBL yang menunjukkan peran terbatas pertahanan fisik konstitutif memainkan peran terbatas dalam resistensi SRD pasca-infeksi pada Phalaenopsis. Asam jasmonat/etilen (JA/ET) berperan penting dalam pertahanan terinduksi terhadap patogen nekrotrofik. Aplikasi eksogen MeJA secara signifikan mengurangi severitas gejala PBL pada genotipe Phalaenopsis yang rentan yaitu P. amabilis ‘Jawa Barat’ and P. pulcherrima ‘Aceh’, meskipun tingkat resistensi yang diinduksi bervariasi antar genotipe. Konsentrasi 1 mM MeJA mampu menginduksi ketahanan, sedangkan konsentrasi yang lebih tinggi (hingga 10 mM) gagal menginduksi resistensi dan memicu senesens daun pada P. pulcherrima ‘Aceh’. Temuan ini menunjukkan pentingnya jalur jasmonat dalam resistensi PBL pada Phalaenopsis. Oleh karena itu, penelitian lebih lanjut diperlukan untuk membuktikan mekanisme resistensi SRD yang diinduksi, terutama melalui regulasi terpenoid. Studi ini juga mengeksplorasi pengembangan marka molekuler dari open reading frame (ORF) gen faktor transkripsi NAC29 yang diekspresikan secara berbeda pada infeksi PBL. Multiple sequence alignment dari sekuen NAC29 di sepuluh spesies Phalaenopsis mengungkapkan variasi SNP dan indel yang tersebar di seluruh ORF. Konservasi tinggi ditemukan di domain NAC, sementara wilayah aktivasi transkripsi ditemukan sangat bervariasi. Tidak ada mutasi yang secara spesifik terdapat pada spesies tahan dan rentan. Lima penanda SNAP dikembangkan berdasarkan SNP bialelik untuk menganalisis keragaman genetik pada tingkat subgenus. Empat dari lima primer memiliki nilai polymorphism information content yang moderat; namun, dua dari penanda ini memiliki frekuensi null allele yang tinggi. Penggunaan hanya lima primer tidak cukup untuk membedakan spesies dari subgenus yang berbeda secara jelas. Secara keseluruhan, hasil penelitian ini menunjukkan kompleksitas mekanisme resistensi SRD pada Phalaenopsis dan menekankan perlunya studi fungsional dan genomik lebih lanjut untuk memungkinkan strategi pemuliaan resistensi yang efektif.