Peningkatan Kandungan Reserpine pada Pule Pandak (Rauvolfia serpentina) Melalui Kultur Sel

Abstract

Rauvolfia seperntina atau pule pandak merupakan tanaman evergreen shrub yang termasuk ke dalam tanaman berkayu sekaligus spesies terpenting dari genus Rauvolfia yang kaya kandungan senyawa-senyawa metabolit yang bersifat terapeutik. Keragaman peran farmakologis pule pandak tidak selaras dengan kelestariannya yang termasuk ke dalam kelompok terancam punah. Sulitnya pertumbuhan konvensional pada tanaman pule pandak karena viabilitas benih yang buruk, tingkat perkecambahan yang rendah, serta terjadinya variasi genetik pada populasi sehingga dalam mengatasi permasalahan-permasalahan tersebut kultur in vitro dapat menjadi solusinya.

Informasi mengenai penerapan metode kultur sel pada pule pandak masih relatif terbatas, khususnya pemanfaatan eksplan kalus yang berasal dari jaringan akar hasil kultur in vitro. Jenis dan konsentrasi zat pengatur tumbuh (ZPT) mampu mempengaruhi keberhasilan induksi kalus serta akumulasi senyawa reserpine sebagai dasar pengoptimalan metode kultur sel. Kalus yang dihasilkan pada media induksi kalus terbaik kemudian dilanjutkan pada tahap pengoptimalan metode kultur sel dalam menentukan konsentrasi elisitor dan kondisi lingkungan dalam pertumbuhan biomassa dan peningkatan senyawa reserpine yang lebih baik. Tujuan umum penelitian yaitu menentukan metode optimal inisiasi dan produksi kalus sebagai sumber eksplan serta merancang metoda kultur suspensi sel yang mampu meningkatkan senyawa reserpine pada media cair.

Penelitian ini terdiri atas dua pecobaan, percobaan pertama merupakan induksi kalus dan percobaan kedua merupakan kultur sel. Percobaan pertama bertujuan mengevaluasi pengaruh kombinasi auksin (2,4-D dan NAA) dengan sitokinin (BAP dan KIN) pada beberapa taraf terhadap kuantifikasi reserpine. Percobaan ini menggunakan rancangan acak lengkap dengan satu faktor yaitu media kultur [Kontrol (MS); A (MS + 2,4-D 1 ppm + BAP 2 ppm); B (MS + 2,4-D 2 ppm + BAP 1 ppm); C (MS + 2,4-D 3 ppm); D (MS + NAA 1,5 ppm + KIN 1 ppm); E (NAA 2,5 ppm + KIN 2,5 ppm); F (NAA 3ppm + KIN 3 ppm) . Eksplan yang digunakan berupa potongan-potongan (± 0,7 cm) akar dari planlet umur 3-4 bulan pada media MS + IBA 0,1 ppm. Setiap perlakuan terdiri atas 8 ulangan. Hasil percobaan menunjukkan bahwa media F membuktikan hasil terbaik pada persentase keberhasilan induksi kalus (100%), bobot basah (4,48 g), bobot kering (2,30 g), lama induksi kalus (21,4 hari), dan tipe kalus berupa kalus rooty. Media F dan B menunjukkan media terbaik untuk menginduksi kalus dengan kuantitas reserpine tertinggi dengan nilai secara berurut adalah 32,36 dan 22,22 mg g-1BK.

Percobaan kedua bertujuan untuk menganalisis pengaruh elisitasi menggunakan metil jasmonat (MeJA) serta pengondisian sistem kultur melalui pengaturan kecepatan rotasi rotary shaker pada media cair upaya untuk peningkatan akumulasi senyawa reserpine. Percobaan ini menggunakan rancangan acak lengkap dengan dua faktor yaitu konsentrasi MeJA (0, 50, 100, 200 µM) dan kecepatan rotasi (0 dan 100 rpm). Kalus hasil percobaan sebelumnya dengan bobot ± 2 g dimasukkan ke dalam media F dalam bentuk cair. Penambahan elisitor dan pengondisian lingkungan berdasarkan masing-masing perlakuan, yang diulang sebanyak 5 kali setiap perlakuannya. Hasil percobaan menunjukkan bahwa terdapat pengaruh interaksi antara penambahan MeJA dan kecepatan rotasi terhadap laju pertumbuhan 2, growth index 2, dan kuantitas reserpine yang dihasilkan. Hasil percobaan menunjukkan bahwa penambahan MeJA 200 µM tanpa diberikan kecepatan rotary shaker menunjukkan ketiga nilai variabel tertinggi dengan nilai 2,26 g; 7,15%; dan 221,81 mg g-1BK. Konsentrasi MeJA menunjukkan perngaruh terhadap bobot kering dan kadar air dan kecepatan rotasi tidak menunjukkan pengaruh terhadap keseluruhan variabel.

Rauvolfia serpentina or Indian snakeroot is an evergreen shrub that belongs to the woody plant family and is the most important species of the Rauvolfia genus, which is rich in therapeutic metabolites. The diversity of Indian snakeroot's pharmacological roles is not in line with its conservation status, which is classified as endangered. Conventional growth of Indian snakeroot is difficult due to poor seed viability, low germination rates, and genetic variation in the population. In vitro culture can be a solution to these problems.

Information on the application of cell culture methods in Indian snakeroot is still relatively limited, especially the use of callus explants derived from root tissue resulting from in vitro culture. The type and concentration of plant growth regulators (PGRs) can influence the success of callus induction and the accumulation of reserpine compounds as a basis for optimizing cell culture methods. The callus produced in the best callus induction medium is then continued to the cell culture method optimization stage to determine the elisitor concentration and environmental conditions for better biomass growth and reserpine compound enhancement. The general objective of this study is to determine the optimal method for callus initiation and production as an explant source and to design a cell suspension cultivation method capable of enhancing reserpine compounds in liquid media.

This study consisted of two experiments, the first being callus induction and the second being cell culture. The first experiment aimed to evaluate the effect of combinations of auxins (2,4-D and NAA) with cytokinins (BAP and KIN) at several levels on reserpine quantification. The experiment used a completely randomized design with one factor, namely culture media [Control (MS); A (MS + 2,4-D 1 ppm + BAP 2 ppm); B (MS + 2,4-D 2 ppm + BAP 1 ppm); C (MS + 2,4-D 3 ppm); D (MS + NAA 1.5 ppm + KIN 1 ppm); E (NAA 2.5 ppm + KIN 2.5 ppm); F (NAA 3 ppm + KIN 3 ppm) . The explants used were root segments (± 0.7 cm) from 3 to 4 month-old plantlets on MS + IBA 0.1 ppm medium. Each treatment consisted of 8 replicates. The results showed that medium F proved to be the best in terms of callus induction success rate (100%), fresh weight (4.48 g), dry weight (2.30 g), callus induction time (21.4 days), and callus type, which was rooty callus. Media F and B showed the best media for inducing callus with the highest reserpine content with values of 32.36 and 22.22 mg g-1DW, respectively.

The second experiment aimed to analyze the effect of elicitation using methyl jasmonate (MeJA) and conditioning the culture system by adjusting the rotation speed of the rotary shaker in liquid media in an effort to increase the accumulation of reserpine compounds. This experiment used a completely randomized design with two factors, namely MeJA concentration (0, 50, 100, 200 µM) and rotation speed (0 and 100 rpm). Callus from the previous experiment weighing ± 2 g was placed in liquid F medium. Then, elicitor addition and environmental conditioning were based on each treatment, which was repeated 5 times for each treatment. The results showed that there was an interaction effect between MeJA addition and rotation speed on growth rate 2, growth index 2, and the quantity of reserpine produced. The experimental results showed that the addition of 200 µM MeJA without the addition of rotary shaker speed showed the highest values for the three variables, with values of 2.26 g, 7.15%, and 221.81 mg g-1DW. The MeJA concentration showed an effect on dry weight and moisture content, while the rotation speed showed no effect on all variables.