Biosistematika, Genomik, dan Metabolomik Novel Aktinobakteri Asal Indonesia yang Berpotensi sebagai Agen Anti-Mycobacterium smegmatis

Abstract

Kasus tuberkulosis (TB) resisten obat menjadi tantangan besar dalam pengendalian TB secara global sehingga mendorong upaya pencarian agen anti-TB baru. Metabolit sekunder yang dihasilkan oleh aktinobakteri merupakan sumber potensial senyawa bioaktif terutama dari Genus Streptomyces. Walaupun demikian, kelompok non-Streptomyces juga berpotensi menghasilkan senyawa unik dan belum banyak dieksplorasi. Eksplorasi aktinobakteri dari habitat atau lokasi yang sama sering menghasilkan reisolasi spesies dan senyawa yang sudah diketahui. Penelitian ini fokus pada koleksi aktinobakteri dari tiga habitat di Indonesia yaitu gua karst Pulau Sumba, tanah rizosfer di taman nasional Gunung Merapi dan Laiwangi Wanggameti, serta sedimen mangrove di Kalimantan Timur yang belum dieksplorasi potensinya. Mycobacterium smegmatis digunakan sebagai bakteri model karena merupakan bakteri nonpatogen, serta memiliki struktur biokimia dan dinding sel yang mirip dengan Mycobacterium tuberculosis. Tujuan utama penelitian ini adalah menemukan novel aktinobakteri asal Indonesia yang berpotensi sebagai agen anti-Mycobacterium. Secara garis besar studi ini terbagi menjadi 4 bagian. Bagian pertama bertujuan untuk mengkarakterisasi keanekaragaman aktinobakteri dari tiga habitat untuk menemukan spesies baru serta mengevaluasi aktivitasnya terhadap Mycobacterium smegmatis wild type (WT-M.smeg). Sebanyak 224 ekstrak etil asetat isolat aktinobakteria diuji aktivitasnya menggunakan metode resazurin microplate assay (REMA). Sebanyak 35 ekstrak (15,63%) memiliki aktivitas penghambatan >40%, dan 19 di antaranya memiliki penghambatan kuat >80%. Isolat potensial terbanyak berasal dari tanah rizosfer (18 isolat). Isolat dengan penghambatan >40% kemudian diidentifikasi berdasarkan gen 16S rRNA dan mengungkap 13 genus berbeda dengan Streptomyces sebagai genus dominan. Strain SMS 1(5)aT ditetapkan sebagai kandidat spesies baru dalam genus Peterkaempfera dan menunjukkan aktivitas penghambatan sebesar 48,32%. Sementara itu, isolat dengan penghambatan >80% (termasuk KRST 03-10) dianalisis lebih lanjut aktivitasnya terhadap M. smegmatis resisten antibiotik yang dibahas secara khusus pada bagian keempat studi ini. Bagian kedua bertujuan untuk mengkarakterisasi kandidat spesies baru strain SMS 1(5)aT melalui pendekatan taksonomi polifasik yang meliputi analisis genotipik, genomik, fenotipik, kemotaksonomi, serta analisis biosythetic gene clusters (BGC). Strain SMS 1(5)aT diisolasi dari tanah rizosfer Podocarpus rumphii di Taman Nasional Laiwangi Wanggameti, Pulau Sumba. Strain SMS 1(5)aT memiliki tingkat kemiripan gen 16S rRNA tertinggi dengan Peterkaempfera griseoplana NRRL B-3064? sebesar 98,89%. Ukuran genom strain ini adalah 8,8 Mb dengan kandungan G+C DNA sebesar 72 mol%. Nilai digital DNA-DNA hybridization dan average nucleotide identity antara strain SMS 1(5)aT dan P. griseoplana NRRL B-3064T masing-masing sebesar 41,9% dan 90,47% yang berada di bawah ambang batas yang ditetapkan untuk delimitasi spesies. Hasil ini mendukung status strain SMS 1(5)aT sebagai spesies baru. Strain SMS 1(5)aT mampu tumbuh pada suhu 15-40?°C, dalam rentang pH 5–8, serta toleran terhadap NaCl hingga konsentrasi 2% (b/v). Hidrolisat sel dari strain ini mengandung LL asam diaminopimelat dan gula utama adalah glukosa, manosa, dan ribosa. Menaquinon utama adalah MK-9(H8) dan profil lipid polar terdiri atas fosfatidiletanolamin, fosfatidilinositol, serta difosfatidilgliserol. Asam lemak utama strain SMS 1(5)a? adalah iso-C15:0. Analisis genom mengidentifikasi beberapa BGC berpotensi sebagai antibakteri dengan kemiripan rendah atau tidak memiliki kecocokan dengan BGC referensi. Berdasarkan keseluruhan data yang diperoleh, strain SMS 1(5)a? ditetapkan sebagai spesies baru dengan nama Peterkaempfera podocarpi sp. nov. (InaCC A1244T = NBRC 116964T). Bagian ketiga bertujuan untuk mengevaluasi potensi P. podocarpi sp. nov. dalam menghambat pertumbuhan M. smegmatis resisten rifampisin (RIFR-M.smeg), isoniazid (INHR-M.smeg), dan multidrug resistant (MDR-M.smeg), serta menganalisis profil metabolit sekunder menggunakan GC-MS dan LC-HRMS. Peterkaempfera podocarpi sp. nov. menunjukkan aktivitas penghambatan tergolong rendah terhadap WT-M.smeg, INHR-M.smeg, dan MDR-M.smeg dengan nilai IC50 masing-masing sebesar 479,3 µg/mL, 552,4 µg/mL, dan 671,2 µg/mL, sedangkan terhadap RIFR-M.smeg tidak menunjukkan aktivitas. Analisis GC-MS mengidentifikasi 2,4-di-tert-butylphenol yang telah diketahui bepotensi sebagai senyawa anti-TB, sedangkan analisis LC-HRMS mendeteksi piperidione, oleamide, nicotinic acid, dan azobenzene yang berpotensi sebagai antimikrob. P. podocarpi sp. nov. memiliki senyawa dominan NP-011220 yang belum teridentifikasi dan tidak memiliki kecocokan dengan basis data yang ada. Bagian keempat bertujuan untuk mengevaluasi potensi ekstrak dengan aktivitas penghambatan >80% terhadap RIFR-M.smeg, INHR-M.smeg, dan MDR-M.smeg, serta analisis metabolomik isolat paling potensial. Isolat KRST 03-10 menghasilkan aktivitas penghambatan paling kuat dengan nilai IC50 terhadap WT-M.smeg, RIFR-M.smeg, INHR-M.smeg, dan MDR-M.smeg masing-masing adalah 9,63?µg/mL, 29,64?µg/mL, 10,89?µg/mL, dan 27,76?µg/mL. Berdasarkan identifikasi gen 16S rRNA, isolat ini memiliki kemiripan dengan Streptomyces cinereoruber NBRC 12756T (98,91%). Analisis GC-MS ekstrak KRST 03-10 mengidentifikasi 2,4-di-tert-butylphenol yang telah diketahui berpotensi sebagai senyawa anti-TB. Analisis LC-HRMS mendeteksi L-a-palmitin, nocardamine, erucamide, dan 2-anisic acid yang diketahui berpotensi sebagai antimikrob. Analisis metabolomik menunjukkan adanya senyawa yang sama antara P. podocarpi sp. nov. dan Streptomyces sp. KRST 03-10 diantaranya 2,4-di-tert-butylphenol dan NP-011220 yang merupakan senyawa dominan pada keduanya. Kebaruan penelitian ini meliputi: (1) penemuan dan deskripsi spesies baru P. podocarpi sp. nov. yang telah dipublikasikan secara resmi dan ditetapkan sebagai strain rujukan (type strain), (2) identifikasi kandidat BGC baru yang tidak memiliki kecocokan dengan database yang tersedia, (3) pengungkapan profil metabolomik P. podocarpi sp. nov. yang menunjukkan senyawa dominan yang tidak memiliki kecocokan dengan basis data, serta (4) ditemukannya Streptomyces KRST 03-10 dari tanah gua karst Pulau Sumba yang memiliki senyawa dominan mirip dengan P. podocarpi sp. nov. dan juga tidak terdeteksi kecocokannya dalam basis data.