Eksplorasi dan Kajian Bakteri Kitinolitik sebagai Agens Hayati serta Peran Kitinase dalam Menekan Ganoderma boninense

Abstract

Kelapa sawit (Elaeis guineensis Jacq) merupakan komoditas tanaman perkebunan utama Indonesia saat ini. Luas areal lahan kelapa sawit terus bertambah setiap tahunnya, namun peningkatan produksi dan produktivitasnya belum optimum. Produksi kelapa sawit mengalami fluktuasi dalam rentang tujuh tahun terakhir. Salah satu faktor penyebab fluktuasi ini adalah gangguan kesehatan tanaman, termasuk faktor cekaman abiotik maupun biotik. Cendawan Ganoderma boninense penyebab penyakit busuk pangkal batang (BPB) menjadi faktor cekaman biotik paling serius pada kelapa sawit saat ini. Berbagai pendekatan pengendalian telah dilakukan, seperti penggunaan tanaman tahan, metode fisik/mekanik, kultur teknis, kimiawi dan pengendalian hayati, namun belum diperoleh hasil pengendalian yang benar-benar memuaskan. Pengendalian hayati memiliki potensi dan prospek yang perlu terus dikembangkan untuk membangun system pengendalian yang efektif, berkelanjutan dan ramah lingkungan. G. boninense sebagai pathogen dari kelompok cendawan sejati diketahui memiliki struktur utama dinding selnya berupa kitin dan glukan. Sementara itu, jenis agens hayati dari kelompok bakteri kitinolitik diharapkan memiliki kemampuan aktivitas antagonisme yang kuat terhadap cendawan patogen melalui mekanisme lisis senyawa kitin dari dinding sel patogen. Penelitian ini bertujuan untuk menentukan isolat bakteri kitinolitik yang mampu mendegradasi kitin dan mampu berperan sebagai agens hayati bagi cendawan G. boninense, serta mengonfirmasi peran kitinase dalam menekan G. boninense. Eksplorasi bakteri kitinolitik dilakukan dalam beberapa tahap yang meliputi: Pengambilan sampel sumber isolasi bakteri kitinolitik, yaitu tanah dari lahan Perkebunan Kelapa Sawit Cikabayan IPB, cairan proteolase tumbuhan kantong semar, usus hewan cicak, feses burung walet, benih padi, tanah asal persawahan di Kabupaten Brebes dan Nganjuk; isolasi bakteri dari berbagai sampel; skrining bakteri pada medium koloidal kitin agar; konfirmasi molekuler gen chiA dari bakteri kitinolitik terpilih; serta pengukuran indeks kitinolitik bakteri penghasil enzim kitinase. Seleksi bakteri kitinolitik sebagai agens hayati G. boninense dilakukan dalam beberapa tahap yang meliputi: Penyediaan isolat G. boninense, uji potensi bakteri kitinolitik dalam menghambat pertumbuhan G. boninense secara in vitro, uji keamanan hayati, karakterisasi bakteri kitinolitik (uji pelarutan fosfat, fiksasi nitrogen, dan produksi IAA), seleksi bakteri kitinolitik potensial menggunakan analytical hierarchy process (AHP), identifikasi bakteri kitinolitik secara molekuler, uji fitotoksisitas, dan uji efikasi bakteri kitinolitik dalam menghambat penyakit busuk pangkal batang secara in vivo. Konfirmasi peran kitinase dari bakteri kitinolitik dilakukan melalui metode mutasi gen kitinase menggunakan teknik UV mutagenesis serta kloning dan ekspresi gen kitinase. Tahap teknik UV mutagenesis mencakup tahap pemaparan bakteri kitinolitik dengan sinar UV, seleksi mutan potensial berdasarkan survival rate 1%, seleksi mutan pada medium koloidal kitin, dan uji kemampuan mutan terhadap pertumbuhan G. boninense. Tahap kloning dan ekspresi gen kitinase terdiri atas isolasi DNA total, sintesis dan optimalisasi primer, amplifikasi DNA kitinase, ligasi gen kitinase pada plasmid pTZ57R, transformasi plasmid pada sel kompeten E. coli DH5a, seleksi dan uji transforman dalam menghambat G. boninense. Seleksi dari total 750 isolat bakteri diperoleh 31 isolat (4,31%) yang memiliki kemampuan mendegradasi kitin. Sampel benih padi ciherang memebrikan kontribusi terbanyak jumlah isolate bakteri kitinolitik yaitu sebesar 20%. Gen kitinase berhasil dideteksi dari 29 isolat tersebut menggunakan PCR dengan degenerate primer. Nilai indeks kitinolitik berkisar antara 0,33 hingga 7,48. Isolat yang memeiliki indeks kitinolitik terendah dan tertitnggi berturut-turut adalah isolat Br11 dan Cb2. Kemampuan penghambatan dari 31 isolat bakteri kitinolitik terhadap senyawa bioaktif G. boninense berkisar antara 7,31%- 80,60%, sedangkan penghambatan senyawa volatil berkisar antara 6,76%-77,69%. Uji keamanan hayati berhasil memisahkan 10 isolat bakteri yang memiliki potensi sebagai patogen, terdiri atas 6 isolat berpotensi sebagai patogen tanaman, 5 isolat berpotensi sebagai patogen hewan mamalia, dan 1 isolat berpotensi sebgai patogen untuk memiliki keduanya. Karakterisasi kemampuan bakteri kitinolitik dilakukan terhadap 21 isolat. Sebanyak 7 isolat mampu memproduksi hormon IAA, 18 isolat mampu memfiksasi nitrogen, dan 12 isolat menunjukkan adanya aktivitas pelarutan fosfat. Seleksi bakteri kitinolitik unggul menggunakan AHP dengan kriteria penghambatan terhadap G. boninense, keamanan hayati, dan karakter bakteri didapatkan 5 isolat teratas yaitu Cb6, Cb7, Cb21, Uc14, dan Br14. Identifikasi kelima isolat bakteri tersebut secara molekuler berdasarkan gen 16S berturut-turut identik dengan spesies bakteri Chromobacterium vaccinii, Serratia marcescens, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, dan Lysinibacillus fusiformis. Isolat bakteri C. vaccinii, S. marcescens, P. fluorescens, P. aeruginosa, dan L. fusiformis bersifat non-fitotoksik bagi bibit kelapa sawit. Kelima isolat bakteri diaplikasikan sebagai perlakuan preventif pada tanaman bibit kelapa sawit sebelum diinokulasi G. boninense. Kejadian penyakit mulai muncul pada 9 minggu setelah inokulasi (MSI) untuk perlakuan C. vaccinii (Cb6), S. marcescens (Cb7) dan kontrol. Gejala nekrotik akar terlihat di semua perlakuan pada minggu ke-12. Perlakuan P. aeruginosa (Uc14) dan fungisida memberikan kejadian penyakit paling rendah dan tidak berbeda nyata antar keduanya. Keparahan penyakit juga muncul pada 9 MSI dan terus meningkat hingga 12 MSI. Semua isolat bakteri mampu menekan keparahan penyakit. P. fluorosens dan P. aeruginosa mampu menekan keparahan penyakit hingga tingkat paling rendah seefektif dengan perlakuan fungisida. Kelima isolat bakteri juga diaplikasikan sebagai perlakuan kuratif pada bibit kelapa sawit yang telah diinokulasi G. boninense terlehi dahulu. Kejadian penyakit mulai terlihat pada 9 MSI pada perlakuan C. vaccinii (Cb6) dan kontrol. Perlakuan P. fluoroscens (Cb21), P. aeruginosa (Uc14), dan L. fusiformis (Br14) menghasilkan tingkat kejadian penyakit yang lebih rendah daripada kontrol. Keparahan penyakit secara nyata terjadi pada tanaman hasil perlakuan C. vaccinii (Cb6) dan kontrol pada 9 MSI. Perlakuan isolat C. vaccinii (Cb6), dan P. fluoroscens (Cb21) mampu menekan keparahan penyakit yang setara secara statistik dengan perlakuan fungisida. Nilai AUDPC perlakuan preventif memiliki rentang 0,70 hingga 7,68. Nilai terendah adalah aplikasi P. aeruginosa dan lebih rendah dibanding aplikasi fungisida. Pada perlakuan kuratif aplikasi fungisida merupakan aplikasi yang memiliki nilai AUDPC terendah sedangkan perlakuan bakteri memiliki rentang AUDPC 1,21 hingga 2,58 unit. Semakin rendah nilai AUDPC maka semakin kuat pengaruh penekanan perlakuan terhadap patogen. Efikasi aplikasi bakteri kitinolitik pada perlakuan preventif Cb6, Cb7, Cb21, Uc14, Br14, dan fungisida secara berurutan adalah 64%, 64%, 54%, 88%, 80%, dan 86%. Sedangkan pada perlakuan kuratif sebesar 43%, 19%, 62%,49%, 39%, dan 93%. Konfirmasi peran kitinase dalam menekan pertumbuhan G. boninense dilakukam pada bakteri kitinolitik dengan mutasi gen kitinase menggunakan metode UV mutagenesis diperoleh 16 bakteri mutan kitinase yaitu Ks10Chi-1,-2, -3, -4, -5, -6, -10, -11, -12, -13, -14, -15, -16, -17, -19, dan -20. Kemampuan 13 mutan dalam menekan pertumbuhan G. boninense memiliki rentang 15 hingga 38%, relatif berkurang dibandingkan wild-type yang memiliki penekanan 63%. Sedangkan 3 mutan lainnya telah kehilangan kemampuannya dalam menekan G. boninense (Ks10Chi- 1, 5, 6). Kloning gen kitinase dihasilkan primer C_PseudomonasF (5`-TCA GCG CAG CGG CCG CCA G-3`) dan C_PseudomonasR (5`-ATG ATC AGG ATC GAC TTT TC-3`) yang digunakan untuk amplifikasi gen kitinase dan menghasilkan amplikon ukuran ±1000 bp. Amplikon telah disikuensing dan menunjukkan hasil sebagai gen kitinase Pseudomonas aeruginosa PAO1 dengan query cover 37% dan homologi 91,86%. Amplikon telah diligasi pada vektor PTZ57R dan ditransformasi pada bakteri E. coli DH5a. Efisiensi transformasi vektor pTZ57R:chiAUc14 mencapai 8,08% Insert pada plasmid telah dipastikan gen kitinase setelah diverifikasi melalui PCR dengan primer kitinase dan primer pengapit pada plasmid.