Introduksi Gen OsGERLP ke dalam Genom Tanaman Kentang Kultivar IPB CP3

Abstract

Lahan marginal merupakan lahan suboptimal yang digunakan untuk produksi pertanian karena memiliki kualitas tanah yang kurang subur. Salah satu lahan marginal yang dapat dimanfaatkan untuk mendukung produksi tanaman pangan adalah tanah masam. Faktor utama yang menghambat produksi tanaman pada tanah masam adalah cekaman abiotik berupa toksisitas aluminium (Al). Gen OsGERLP merupakan gen toleransi cekaman Al yang telah berhasil diisolasi dari tanaman padi kultivar Hawara Bunar. Berdasarkan analisis ekspresi gen, diduga bahwa gen OsGERLP merupakan regulator utama dari beberapa gen toleransi cekaman Al pada padi. Potensi gen OsGERLP dapat dimanfaatkan untuk meningkatkan toleransi tanaman pangan lain terhadap cekaman Al, seperti kentang. Salah satu kentang budidaya adalah tanaman kentang cv. IPB CP3 yang dihasilkan oleh Prof. Suharsono dari Pusat Bioteknologi IPB. Kentang cv. IPB CP3 ini merupakan kultivar baru hasil mutasi dari kentang ‘Agria’. Potensi produksi kentang cv. IPB CP3 cukup tinggi dan cocok digunakan sebagai bahan baku pembuatan keripik dan kentang goreng. Upaya peningkatan produksi kentang terus dilakukan melalui perbaikan teknik budidaya dan perluasan areal tanam yang diarahkan pada pemanfaatan lahan suboptimal, seperti lahan masam dari perkebunan teh. Kultivar ini belum terbukti toleran terhadap Al, sehingga diperlukan peningkatan toleransinya melalui transformasi genetik. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan kentang transgenik cv. IPB CP3 yang mengandung gen OsGERLP dan toleran terhadap cekaman Al. Penelitian ini terdiri atas sembilan tahapan yaitu, 1) transformasi pH35YG-OsGERLP ke dalam bakteri Escherichia coli TOP10, 2) introduksi vektor ekspresi pH35YG ke dalam Agrobacterium tumefaciens LBA4404, 3) perbanyakan tanaman kentang, 4) perbanyakan A. tumefaciens LBA4404, 5) transformasi genetika tanaman kentang, 6) analisis integritas DNA total dengan teknik PCR menggunakan gen aktin, 7) analisis integrasi gen OsGERLP, 8) uji cekaman Al secara in vitro, dan 9) analisis ekspresi gen. Plasmid pH35YG-OsGERLP ditransformasikan ke dalam bakteri E. coli TOP10 menggunakan metode heat shock dan diintroduksikan ke dalam A. tumefaciens LBA4404 menggunakan metode Triparental Mating. Transformasi genetik tanaman kentang dilakukan dengan metode kokultivasi menggunakan bakteri A. tumefaciens LBA4404 yang membawa plasmid pH35YG-OsGERLP. Ruas batang tanpa mata tunas digunakan sebagai eksplan untuk transformasi. Uji toleransi tanaman kentang terhadap cekaman Al dilakukan dengan menggunakan rancangan acak lengkap dua faktor perlakuan dan tiga kali ulangan. Analisis ekspresi gen dilakukan dari tanaman uji cekaman Al secara in vitro dari tiga media perlakuan yaitu media pH 5,8, media pH 4, dan media pH 4 + Al. Plasmid pH35YG-OsGERLP telah berhasil diintroduksikan ke dalam A. tumefaciens LBA4404 ditandai dengan hasil PCR koloni yang mengamplifikasi gen target berukuran 339 bp. Nilai efisiensi transformasi yang dicapai relatif tinggi yaitu sebesar 47,03%, dengan efisiensi regenerasi sebesar 42,19%. Analisis integritas DNA melalui teknik PCR menggunakan primer aktin menunjukkan semua tanaman transgenik dan non-transgenik memiliki kualitas DNA yang baik. Analisis integrasi gen OsGERLP menggunakan sepasang primer 35S-F1 dan GERLP-R menunjukkan bahwa enam klon transgenik putatif mengandung gen OsGERLP di bawah kendali promotor CaMV 35S yang kuat dengan ukuran pita 1500 bp. Analisis toleransi terhadap cekaman Al secara in vitro menunjukkan bahwa klon transgenik memiliki panjang dan jumlah akar yang lebih tinggi dibandingkan dengan klon non-transgenik. Klon transgenik CP3GERLP2, CP3GERLP3, dan CP3GERLP4 menunjukkan pertumbuhan akar yang paling baik dalam kondisi tercekam Al. Analisis ekspresi gen melalui qRT-PCR menunjukkan pola ekspresi yang relatif sama pada semua media yaitu pH 5,8, pH 4, dan pH 4 +Al. Gen OsGERLP diekspresikan lebih tinggi pada klon transgenik CP3GERLP2, CP3GERLP3, dan CP3GERLP4 dibandingkan dengan tanaman non-transgenik. Ketiga klon tersebut berpotensi untuk dikembangkan menjadi varietas kentang toleran Al.

Marginal land is suboptimal land used for agricultural production due to poor soil quality. One type of marginal land that can be utilised to support food crop production is acid soil. The main factor inhibiting crop production on acid soil is abiotic stress in the form of aluminium (Al) toxicity. The OsGERLP gene is an Al stress tolerance gene that has been successfully isolated from the Hawara Bunar rice cultivar. Based on gene expression analysis, it is suspected that the OsGERLP gene is the main regulator of several Al stress tolerance genes in rice. The potential of the OsGERLP gene can be utilised to increase the tolerance of other food crops to Al stress, such as potatoes. One of the potato cultivars that was developed by the IPB Biotechnology Centre is cv. IPB CP3, which is a new cultivar derived from a mutated 'Agria' potato. The production potential of the cv. IPB CP3 is quite high and suitable as a raw material for chips and french fries. Efforts to increase potato production can be done through intensification of cultivation techniques and extensification of planting areas, focusing on utilising suboptimal land, such as acid land. The cultivar has not been proven to be tolerant to low pH and high Al, therefore its tolerance needs to be improved through genetic transformation. This research aims to produce transgenic potatoes cv. IPB CP3 containing the OsGERLP gene that tolerant to Al stress. The research consists of nine activities, i.e., 1) transformation of pH35GY-OsGERLP into E. coli TOP10 bacteria, 2) introducing the pH35YG expression vector into A. tumefaciens LBA4404, 3) propagation of potato plants, 4) propagation of A. tumefaciens, 5) genetic transformation of potato plants, 6) analysis of total DNA integrity using PCR using the actin gene, 7) analysis of OsGERLP gene integration, 8) in vitro Al stress tolerance assay, and 9) gene expression analysis. The pH35YG-OsGERLP plasmid was transformed into Escherichia coli TOP10 bacteria using the heat shock method and introduced into Agrobacterium tumefaciens LBA4404 using the triparental mating method. Genetic transformation of potato plants was carried out by cocultivation using A. tumefaciens LBA4404 bacteria carrying the pH35YG-OsGERLP plasmid. Stem segments without buds were used as explants for transformation. Potato plant tolerance to Al stress was tested using a completely randomised design with two factors and three replications. The first factor was five potato genotypes, i.e., CP3NT, CP3GERLP1, CP3GERLP2, CP3GERLP3, and CP3GERLP4. The second factor was three planting media with different pH and Al concentration, i.e., pH 5,8, pH 4, and pH 4 + Al. Gene expression analysis was performed on all genotypes treated with different pH media and Al stress. The pH35YG-OsGERLP plasmid was successfully introduced into A. tumefaciens, as indicated by colony PCR amplifying a 339 bp target gene. The transformation efficiency achieved was relatively high at 47.03%, with a regeneration efficiency of 42.19%. DNA integrity analysis using the actin primer showed that all transgenic and non-transgenic plants had good DNA quality. Analysis of OsGERLP gene integration by PCR using a pair of primers, 35S-F1 and GERLP-R, confirmed that six putative transgenic clones carried the OsGERLP gene under the control of the strong CaMV 35S promoter with insert size of 1500 bp. In vitro analysis of tolerance to Al stress showed that transgenic clones had higher root length and number than non-transgenic clones. Transgenic clones CP3GERLP2, CP3GERLP3, and CP3GERLP4 showed the best root growth under Al stress conditions. Gene expression analysis using qRT-PCR showed similar expression patterns in all media, which were pH 5.8, pH 4, and pH 4 + Al. The OsGERLP gene was expressed more highly in transgenic clones CP3GERLP2, CP3GERLP3, and CP3GERLP4 than non-transgenic plants. These three clones have the potential to be developed into Al-tolerant potato varieties.