Deteksi dan Karakterisasi Gen Penyandi Alkohol Dehidrogenase 1 dari Khamir Non-Konvensional: Wickerhamomyces anomalus dan Pichia kudriavzevii.

Abstract

Bioetanol (C2H5OH)merupakan senyawa organik yang diperoleh dari fermentasi monomer gula yang didapatkan dari pati, sukrosa, atau selulosa. Glukosa sebagai bahan baku dipecah oleh mikroorganisme melalui proses fermentasi menjadi etanol . Khamir memiliki kemampuan yang tinggi untuk memfermentasi glukosa menjadi bioetanol. Pichia kudriavzevii IP4 yang diisolasi dari biji kakao memiliki potensi untuk memproduksi etanol dalam kondisi cekaman yang tinggi. Wickerhamomyces anomalus yang diisolasi dari Brem Bali memiliki kemampuan dalam memproduksi etanol hingga 50% pada cekaman etanol dan suhu yang tinggi. Alkohol dehidrogenase1 (ADH1) merupakan enzim yang memiliki peranan penting dalam sintesis senyawa etanol dengan mengkatalisis reaksi reduksi senyawa asetaldehid menjadi etanol. Karakteriasi dari gen alkohol dehidrogenase1 (adh1) memberikan informasi mengenai keberadaan ADH1 yang menjadi indikasi kemampuan fermentasi pada suatu mikroorganisme. Namun, belum ditemukan informasi mengenai model enzim ADH1 dari W. anomalus dan P. kudriavzevii dan masih terbatasnya penelitian terkait interaksinya terhadap substrat. Penelitian ini bertujuan mendeteksi gen adh1 dari W. anomalus dan P. kudriavzevii menggunakan metode PCR dan elektroforesis, dan membangun model enzim ADH1 secara komputasi. Karakterisasi gen dan asam amino berbasis homologi serta molecular docking dilakukan untuk menganalisis hubungan antar organisme serta mengevaluasi interaksi antara protein dan substrat. Gen adh1 diamplifikasi menggunakan PCR, divisualisasi menggunakan elektroforesis, dan dianlisis homologi sekuennya menggunakan BlastN dan BlastP. Struktur enzim dimodelkan menggunakan SWISS-MODEL dan I-TASSER dan divalidasi strukturnya menggunakan Plot Ramachandran, QMEAN4, dan local quality estimation. Molecular docking dilakukan dengan perangkat lunak YASARA dengan ligan uji NADH, asetaldehid, etanol, dan keton. Hasil analisis BlastN dan BlastP dari ketujuh isolat menunjukkan bahwa gen penyandi alkohol dehidrogenase 1 (adh1) berhasil terdeteksi. Selanjutnya, hasil multiple sequence allignment (MSA) dan pohon filogenetik menunjukkan bahwa isolat W. anomalus BT1-BT6 memiliki hubungan kekerabatan evolusi yang dekat dengan ADH1 dari Saccharomyces cerevisiae. Sementara itu, isolat P. kudriavzevii IP4 menunjukkan pola yang berbeda. Model enzim ADH1 yang dimodelkan menggunakan web server SWISS-MODEL menunjukkan kualitas stereokimia terbaik, dengan nilai Ramachandran plot 100% untuk W. anomalus BT1 dan 99,3% untuk P. kudriavzevii IP4. Evaluasi model lebih lanjut mengindikasikan bahwa model enzim memiliki struktur yang baik, berdasarkan interaksi ion Zn2+, nilai QMEAN4, dan nilai local quality estimation. Hasil analisis docking menunjukkan bahwa enzim ini memiliki afinitas yang tinggi dengan NaDH sebagai koenzim serta dapat menggunakan keton sebagai sumber substrat alternatif

Bioethanol (C2H5OH) is an organic compound obtained from the fermentation of sugar monomers derived from starch, sucrose, or cellulose. Glucose, as a primary substrate, is broken down by microorganisms through fermentation into ethanol. Yeasts possess a high capability to ferment glucose into bioethanol. Pichia kudriavzevii IP4, isolated from cocoa beans, exhibits potential for ethanol production under high-stress conditions. Wickerhamomyces anomalus, isolated from Brem Bali, has demonstrated the ability to produce ethanol up to 50% under ethanol and heat stress. Alcohol dehydrogenase 1 (ADH1) is a key enzyme in ethanol biosynthesis that catalyzes the reduction of acetaldehyde into ethanol. Characterization of the alcohol dehydrogenase 1 gene (adh1) provides insight into the presence of ADH1, which serves as an indicator of fermentative capacity in a microorganism. However, the model enzyme of ADH1 from W. anomalus and P. kudriavzevii has not been reported, and research on its substrate interactions still limited. This study aims to detect the adh1 gene from W. anomalus and P. kudriavzevii using PCR and electrophoresis methods and to construct a computational model of the ADH1 enzyme. Gene and amino acid characterization based on homology, as well as molecular docking, were carried out to analyze interspecies relationships and evaluate the interaction between the protein and its substrates. The adh1 gene was amplified using PCR, visualized through electrophoresis, and its sequence homology analyzed using BLASTN and BLASTP. The enzyme structures were modeled using SWISS-MODEL and ITASSER, and the resulting models were validated through Ramachandran plots, QMEAN4 scores, and local quality estimation. Molecular docking was performed using YASARA software with NADH, acetaldehyde, ethanol, and ketone as test ligands. BLASTN and BLASTP analyses of the seven isolates confirmed the successful detection of the adh1 gene encoding alcohol dehydrogenase 1. Furthermore, multiple sequence alignment (MSA) and phylogenetic tree construction revealed that W. anomalus isolates BT1–BT6 share close evolutionary relationships with Saccharomyces cerevisiae ADH1. In contrast, P. kudriavzevii IP4 exhibited a distinct pattern. The ADH1 enzyme models generated using the SWISS-MODEL web server demonstrated optimal stereochemical quality, with Ramachandran plot scores of 100% for W. anomalus BT1 and 99.3% for P. kudriavzevii IP4. Further evaluation of the models indicated good structural integrity, supported by Zn²? ion interaction, QMEAN4 values, and local quality estimation scores. Docking analysis revealed that the enzyme exhibited high affinity for NADH as a coenzyme and could utilize ketones as an alternative substrate source.