Analisis Biodiversitas dan Bioprospeksi Bakteri Simbion Anemon Laut sebagai Anti-Quorum Sensing Vibrio parahaemolyticus

Abstract

Udang adalah salah satu hasil laut yang paling populer dan banyak dikonsumsi di dunia. Pertumbuhan jumlah penduduk mendorong meningkatnya permintaan terhadap produk olahan udang dan sektor akuakultur. Di Asia, budidaya udang menjadi industri strategis dengan kontribusi miliaran dolar setiap tahun dalam ekspor. Di Indonesia sendiri, udang merupakan komoditas akuakultur dengan nilai ekonomi tertinggi dan mendominasi produksi di wilayah perairan payau. Salah satu yang menjadi tantangan adalah wabah penyakit yang disebabkan oleh bakteri patogen dari genus Vibrio, terutama Vibrio parahaemolyticus. V. parahaemolyticus menyebabkan Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease (AHPND) yang dapat menimbulkan kematian pada udang mencapai 100% dalam waktu yang cukup singkat. Berdasarkan hal tersebut, banyak petani menggunakan antibiotik untuk mengatasi permasalahan ini. Penggunaan antibiotik yang berlebihan dapat menyebabkan resistensi, mengakibatkan masalah kesehatan dan dampak negatif bagi ekosistem perairan. Alternatif yang lebih ramah lingkungan diperlukan untuk mengatasi tantangan ini, salah satunya dengan menerapkan mekanisme quorum sensing (QS) dari bakteri V. parahaemolyticus. QS adalah sistem komunikasi yang memungkinkan bakteri mengatur perilaku kolektif berdasarkan kepadatan populasi, dan berperan penting dalam mekanisme virulensi V. parahaemolyticus. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan eksplorasi bakteri simbion dari anemon laut yang dapat menghasilkan enzim dan senyawa yang dapat mengganggu mekanisme QS dari V. parahaemolyticus. Metode yang dilakukan dalam penelitian ini dimulai dari eksplorasi dan isolasi bakteri simbion anemon laut dari kedalaman yang berbeda. Pengambilan sampel anemon dilakukan di Pulau Samalona, Makassar, Sulawesi Selatan. Adapun spesies anemon yang digunakan dalam penelitian ini adalah Entacmaea quadricolor, Heteractis magnifica dan Stichodactyla gigantea pada kedalaman 5 m, 10 m dan 15 m. Isolasi bakteri dilakukan dengan menggunakan metode sebar yang dimulai dengan teknik pengenceran menggunakan media Zobell Marine Agar. Bakteri yang didapatkan dari hasil isolasi kemudian dilanjutkan skrining penghambatan QS dengan bakteri indikator Chromobacterium violaceum. Bakteri yang memiliki penghambatan tinggi diidentifikasi dengan menggunakan primer 16s rRNA dan Whole Genome Sequencing (WGS). Pengujian dilanjutkan terhadap uji anti-QS pada bakteri V. parahaemolyticus, dengan menggunakan ekstrak protein kasar dengan jenis pemurnian yang berbeda (P1: Supernatan; P2: Pengendapan Amonium Sulfat; P3: Pemurnian AKTA; P4: Pemurnian Kromatografi) dan metabolit dengan konsentrasi yang berbeda (0,4; 0,8; 1,2; 1,6 dan 2,0 mg/mL) dari Pseudomonas alcaligenes (bakteri dengan hasil skrining penghambatan QS C. violaceum tertinggi). Jenis pengujian anti-QS yang dilakukan adalah (1) penghambatan biofilm (2) penghambatan biomassa biofilm (3) penghambatan swarming dan swimming dan (4) penghambatan ekspresi gen terkait pembentukan hemolisin, mekanisme QS serta pembentukan flagela dari V. parahaemolyticus. Hasil skrining awal anti-QS pada C. violaceum menunjukkan bahwa beberapa isolat bakteri simbion anemon laut menghambat produksi violacein. Penghambatan tertinggi ditunjukkan oleh isolat SG03 yang hampir sama efektifnya dengan Bacillus subtilis dengan nilai penghambatan sebesar 28.00 mm. Berdasarkan hasil identifikasi molekuler, isolat SG03 tersebut memiliki kemiripan 98% dengan bakteri P. alcaligenes. Berdasarkan hasil analisis WGS memiliki genom sebesar 6.167.140 bp, dan memiliki dua gen pendegradasi AHL, yaitu AHL Laktonase (AiiA) dan AHL Asilase (pvdQ). Pengujian terhadap V. parahaemolyticus menunjukkan perlakuan dengan metabolit pada konsentrasi 2,0 mg/mL menghasilkan degradasi AHL tertinggi sebesar 86,70%, perlakuan protein P4 menghasilkan degradasi tertinggi sebesar 64,05%. Pada penghambatan pembentukan biofilm V. parahaemolyticus, perlakuan metabolit 2,0 mg/mL dan protein P4 menunjukkan penghambatan biofilm tertinggi masing-masing sebesar 91,06% dan 72,44%. Pada pengujian autoagregasi dan hidrofobisitas V. parahaemolyticus, perlakuan metabolit 2,0 mg/mL menunjukkan aktivitas autoagregasi terendah sebesar yaitu 39,92% dan hidrofobisitas terendah sebesar 50,96%. Hasil pengujian penghambatan ekspresi gen V. parahaemolyticus yang terkait pembentukan hemolisin, mekanisme QS dan juga pembentukan flagela, menunjukkan bahwa perlakuan metabolit 2,0 mg/mL dan protein P4 mampu menekan ekspresi gen sampai pada tingkat relatif 50%. Metode uji kandidat probiotik P. alcaligenes SG03 terdiri dari uji osmotoleransi, autoagregasi, ketahanan NaCl, ketahanan pH, resistensi antibiotik, aktivitas hemolisis, proteolitik dan lipolitik. Uji osmotoleransi menunjukkan isolat P. alcaligenes SG03 memiliki densitas tertinggi pada konsentrasi glukosa 20%, sementara densitas menurun pada konsentrasi glukosa yang lebih tinggi. Pada pengujian autoagregasi, densitas meningkat signifikan dari 0,78 pada 18 jam menjadi 0,91 pada 48 jam. Suhu optimal untuk pertumbuhan terdeteksi pada 30°C, dengan densitas tertinggi mencapai 1,74 setelah 48 jam. Pengujian terhadap ketahanan NaCl, P. alcaligenes SG03 menunjukkan CFU tertinggi pada konsentrasi 2% (20,33 x 10¹² pada 48 jam), dan pada bile salt, CFU tertinggi mencapai 27,00 x 10¹² pada konsentrasi 0,1%. Uji ketahanan pH menunjukkan optimal pada pH 5, dengan CFU mencapai 20 x 10¹². Uji bioaktivitas, baik antioksidan maupun antiinflamasi, meningkat seiring waktu inkubasi, dengan nilai tertinggi mencapai masing-masing 53,00% dan 60,33% pada 48 jam. Uji resistensi antibiotik menunjukkan bahwa SG03 resisten terhadap terhadap Penicilin, serta menunjukkan sifat proteolitik. Isolat ini tidak memiliki aktivitas lipolitik dan juga hemolisis. Secara keseluruhan, bakteri simbion meningkatkan kesehatan inang dan membantu melawan patogen dengan memproduksi senyawa bioaktif yang dapat mengganggu komunikasi antar bakteri melalui pemecahan molekul sinyal AHL pada V. parahaemolyticus. Bakteri simbion dapat mengurangi virulensi patogen dan meminimalkan risiko infeksi, sekaligus menjaga keseimbangan mikrobiota dan mendukung sistem imun inang. Keragaman mikrobiota simbion anemon membuka peluang untuk pengembangan produk probiotik dan alternatif terapeutik yang ramah lingkungan.