Uji Integritas Membran Plasma Sperma Menggunakan Dua Metode yang Berbeda pada Semen Beku Kerbau Murrah

Abstract

Kerbau (Bubalus bubalis) merupakan salah satu ternak ruminansia besar yang memiliki potensi tinggi dikembangkan di Indonesia. Rumpun kerbau yang terdapat di Indonesia satu diantaranya adalah kerbau murrah. Kerbau murrah merupakan jenis kerbau perah sebagai penghasil susu, daging dan ternak kerja. Perkembangbiakan ternak kerbau dapat dilakukan dengan kawin alam atau inseminasi buatan (IB). Semen beku untuk program IB setidaknya harus memenuhi standar post thawing motility (PTM) sebesar 40%. Sperma seluruh permukaannya diselimuti oleh membran plasma yang berfungsi sebagai pelindung terhadap perubahan lingkungan dan sistem transpor komponen dari dalam ke luar sel atau sebaliknya. Integritas membran plasma sperma berperan penting untuk menjaga fungsi sperma secara keseluruhan. Sperma dengan integritas membran plasma yang baik dapat bertahan dan melalui serangkaian perubahan kompleks dalam organ reproduksi betina serta mampu untuk membuahi oosit. Evaluasi integritas membran plasma yang aktif dan fungsional oleh karena itu, sangat diperlukan untuk keberhasilan fertilisasi. Metode yang sering digunakan untuk menguji integritas membran plasma sperma ialah Hypo Osmotic Swelling Test (HOS-Test). Prinsip metode ini adalah kemampuan membran plasma sperma di dalam larutan hipo-osmotik. Metode lain yang dapat digunakan untuk memeriksa integritas membran plasma sperma adalah dengan pewarna Carboxyfluorescein diacetate dan propidium iodide (CFDA-PI). Pewarna CFDA mampu menembus membran plasma yang utuh dan berikatan dengan esterase, sehingga dapat mengidentifikasi sel-sel yang hidup sedangkan pewarna PI hanya menembus sel-sel mati. Penelitian ini bertujuan untuk membandingkan integritas membran plasma sperma semen beku kerbau murrah menggunakan HOS-Test dan CFDA-PI. Penelitian menggunakan semen beku dari 4 pejantan kerbau murrah dengan umur berkisar 10-12 tahun. Sampel yang digunakan enam kode batch masing-masing 5 straw, sehingga jumlah total straw yang digunakan sebanyak 120 buah. Semen beku dicairkan terlebih dahulu kemudian dievaluasi motilitas, viabilitas, abnormalitas, status akrosom sperma dan integritas membran plasma sperma dengan HOS-Test dan pewarnaan CFDA-PI. Motilitas sperma diamati menggunakan Computer-assisted sperm analysis (CASA). Penilaian viabilitas sperma menggunakan pewarnaan eosin-nigrosin. Status akrosom sperma dievaluasi menggunakan pewarnaan Fluorescein isothiocyanate peanut agglutinin (FITC-PNA). Pengamatan abnormalitas sperma menggunakan pewarna Carbolfuchsin-eosin (William staining). Uji integritas membran plasma sperma metode HOS-Test dilakukan dengan menambahkan 30 µL sampel semen beku dalam 300 µL larutan HOS-Test, dihomogenkan dan diinkubasi dalam suhu 37 °C selama 30 menit. Pengamatan sperma dilakukan menggunakan mikroskop phase contrast perbesaran 400 X. Sperma dengan integritas membran plasma yang baik menunjukkan reaksi berupa ekor yang menggulung sedangkan sperma dengan membran yang rusak akan ditandai dengan ekor yang lurus. Sperma yang bereaksi dan yang tidak bereaksi dihitung dari total minimal 500 sel. Uji integritas membran sperma metode pewarnaan CFDA-PI dilakukan dengan menambahkan 20 µL sampel semen beku, dalam 40 µL pewarna CFDA dan 5 µL pewarna PI kemudian diinkubasi pada suhu 37 °C selama 10 menit dalam kondisi gelap. Sperma diamati dengan mikroskop fluoresen dengan perbesaran 400x. Sperma dengan integritas membran plasma yang baik berfluoresensi hijau terang, sedangkan membran sperma yang rusak berpendar merah terang serta sel yang berpendar warna hijau dan merah (moribund). Sperma dihitung dengan total minimal 500 sel. Hasil pengujian HOS-Test dan CFDA-PI dianalisis secara statistik menggunakan Independent Sample T-Test dengan taraf nyata 95%. Hasil penelitian ini menunjukkan metode HOS-Test memunculkan dua reaksi sperma yaitu sperma dengan ekor coil (64,83%) dan sperma dengan ekor yang lurus (35,17%). Pengujian dengan pewarnaan CFDA-PI muncul tiga kategori reaksi yaitu sel berwarna hijau (58,97%), sel berwarna merah (28,55%) dan sel dengan warna hijau merah (12,48%). Analisis statistik dengan uji T-Test menunjukkan nilai signifikansi 0,00<0,05 bahwa nilai rata-rata dari kelompok HOS-Test dan CFDA menunjukkan perbedaan yang signifikan. Nilai integritas membran plasma semen beku kerbau murrah yang diuji dengan metode HOS-Test lebih tinggi dibandingkan dengan metode pewarnaan CFDA-PI. Kesimpulan dari hasil penelitian ini adalah penilaian HOS-Test menunjukkan dua kategori reaksi dan CFDA-PI menunjukkan tiga kategori reaksi. Penilaian HOS Test merupakan metode yang murah, cepat dan praktis diaplikasikan dalam skala laboratorium maupun lapangan. Pewarnaan CFDA-PI dapat menjadi metode penilaian lanjut yang lebih akurat dan tepat untuk integritas membran plasma sperma sehingga dapat memberikan dasar yang lebih detail dan tepat untuk menentukan kualitas semen beku.