Aplikasi Marka SSR untuk Identifikasi Segregasi Sifat Ketahanan Penyakit VSD pada Populasi F1 dari Persilangan Klon Kakao MCC 02 X SUL 1

Abstract

Tanaman kakao (Theobrema cacao L.) merupakan salah satu komoditas perkebunan yang memiliki peranan penting bagi perekonomian di Indonesia. Indonesia menempati posisi ketiga sebagai negara produsen kakao di dunia setelah Pantai Gading dan Ghana. Varietas dan klon kakao unggul yang tersedia saat ini terdiri dari varietas mulia dan lindak. Penyakit utama yang menyerang tanaman kakao yaitu Busuk Buah Kakao (BBK), Kanker batang dan penyakit Vascular Streak Dieback (VSD). Penyakit VSD dapat menyebabkan kematian pada klon rentan lebih dari 59%. Penyaki VSD merupakan penyakit yang disebabkan oleh cendawan Ceratobasidium theobromae yang menyerang bagian pembuluh xilem dan mengakibatkan nekrosis daun, absisi hingga tanaman menjadi mati. Perakitan varietas dan klona kakao dapat dilakukan melalui pendekatan konvensional dan inkonvensional. Pemuliaan kakao secara konvensional yang dilakukan melalui metode persilangan dengan waktu yang lama. Sedangkan Pendekatan non-konvensional merupakan pemanfaatan teknik molekuler yang dapat mempersingkat daur seleksi tanaman. Salah satu perbaikan genetik yang sangat penting untuk memberikan perlindungan penyakit utama pada tanaman kakao yaitu dengan satu gen adalah Single Nucleotide Polymorphism (SNP). Selanjutnya untuk mengetahui tanaman resisten dan rentan dapat dilakukan dengan menggunakan penanda marka SSR. Percobaan pertama bertujuan evaluasi keragaman respons ketahanan klon kakao MCC 02 dan Klon kakao Sulawesi 1 terhadap infeksi VSD. Pengujian dilakukan dengan metode Rancangan Acak Kelompok (RAK) dengan 4 ulangan. Dengan metode infeksi bibit kakao secara alami dibawah pohon kakao dewasa yang terserang penyakit VSD. Setiap perlakukan terdiri 2 tanaman klon kakao MCC 02 dan 2 tanaman klon kakao Sulawesi 1 yang di ulang 4 kali, sehingga total 16 tanaman dalam satuan percobaan. Karakter yang diamati adalah klorosis pada ujung daun dengan ciri-ciri (memiliki bintik-bintik berwarna hijau pada satu daun atau tiga daun), nekrosis pada ujung daun atau lembaran daun (lamina) dengan kondisi daun masih menempel pada ranting, ranting gundul (karena sebagian daun gugur), bekas dudukan tangkai daun terlihat tiga titik (noktah) berwarna coklat kehitaman dan jaringan xilem saat dibelah berwarna kehitaman. Hasil penelitian MCC 02 dan SUL 1 cocok untuk membandingkan gen yang terkait dengan respon infeksi penyakit VSD antara kultivar kakao tahan (MCC 02) dan rentan (SUL 1). Percobaan kedua bertujuan untuk isolasi dan karakterisasi keragaman nukleotida gen Chitinase 2 dan PR1 dari kedua tetua MCC 02 dan Sulawesi 1. Prosedur percobaan yaitu melakukan isolasi DNA, penentuan kualitas dan kuantitas, desain primer untuk Amplifikasi PCR, amplifikasi PCR gen Chitinase 2 dan PR1 dan sekuensing fragmen DNA, analisis sekuen berganda, identifikasi SNP, dan analisis filogenetik. Hasil primer spesifik gen berhasil dirancang menggunakan referensi dua gen yang responsif terhadap penyakit, Kitinase (Chi) dan Protein Terkait Patogenesis 1 (PR1), dan digunakan untuk menghasilkan amplikon dari kakao cv. MCC 02 (tahan terhadap VSD) dan Sul 1 (rentan terhadap VSD). Urutan amplikon Chi diduga terpanjang 858 bp, dan hasil analisis BLAST mengkonfirmasiKitinase parsial, mulai dari nomor nukleotida 55 hingga 912 dari urutan kode Chi. Penyelarasan beberapa urutan tujuh aksesi Chi dari kakao cv. MCC02 dan SUL1 mengidentifikasi keberadaan 4 SNP non-sinonim dan dua SNP sinonim di wilayah pengkodean Chi. Terakhir, konstruksi pohon filogenetik pada aksesi Chi dari tanaman kakao cv. MCC 02, SUL 1, dan 21 aksesi dari jenis tanaman terpilih menunjukkan bahwa Chi dari kakao lebih ber kekerabatan dengan Chi dari D. zibethinus dan G. hirsutum dibandingkan aksesi lainnya. Urutan amplikon PR1 yang diduga terpanjang 569 bp, dan hasil analisis BLAST mengkonfirmasi identitasnya sebagai fragmen gen PR1 parsial, mulai dari nomor nukleotida 37 hingga 471 dari urutan pengkodean PR1 dan 134 bp dari urutan 3'-non coding wilayah. Penjajaran urutan ganda tujuh aksesi PR1 dari kakao cv. MCC02 dan SUL1 mengidentifikasi keberadaan 3 SNP non-sinonim dan dua SNP sinonim di wilayah pengkode Chi dan dua SNP di wilayah 3'-non-pengkodean. Terakhir, konstruksi pohon filogenetik pada aksesi PR1 dari tanaman kakao cv. MCC02 dan SUL1, serta 36 aksesi dari jenis tanaman terpilih menunjukkan bahwa PR1 dari kakao lebih berkekerabatan dengan PR1 dari Herrania umbratica dan D. zibethinus dibandingkan dengan aksesi lainnya. Karena MCC 02 resisten VSD dan SUL 1 rentan, temuan penelitian ini dapat menjadi titik awal pengembangan penanda tahan VSD untuk mendukung pemuliaan kakao. Percobaan ketiga bertujuan untuk memvalidasi marka SSR yang terpaut dengan ketahanan terhadap penyakit Vascular Streak Dieback (VSD) pada populasi kakao F1 MCC 02 x Sul 1. Penelitian telah dilaksanakan di Kebun Penelitian Balai kakao F1 MCC 02 x Sul 1. Penelitian telah dilaksanakan di Kebun Penelitian Balai Penelitian Tanaman Industri dan Penyegar (BALLITRI), Sukabumi, Jawa Barat. Penelitian dilaksanakan bulan Januari sampai bulan Mei 2022. Prosedur percobaan Isolasi DNA, penentuan kualitas dan kuantitas dan amplifikasi PCR. Hasil analisis SSR dapat disimpulkan primer mTcCIR42 yang digunakan dalam memvalidasi masih belum mampu memvalidasi tanaman resisten dan tanaman rentan. Karena visualisasi produk PCR untuk jumlah dan ukuran pita DNA-nya sama (monomorfik).