Regenerasi in vitro dan transformasi genetik InMYB1-CCD4? dengan perantara Agrobacterium tumefaciens EHA 105 pada Tagetes erecta

Abstract

Marigold (Tagetes erecta) merupakan komoditas florikultura yang memiliki banyak manfaat terutama sebagai tanaman hias, bunga potong dan bahan baku industri. Marigold memiliki daya tarik dari warna bunga yang beragam, meskipun demikian pemulia tanaman terus berupaya dalam meningkatkan variasi warna bunga tersebut. Salah satu metode yang digunakan untuk modifikasi warna bunga adalah rekayasa genetik. Rekayasa genetik yang dilakukan adalah dengan mengintroduksi gen InMYB1-CCD4? ke dalam genom tanaman dengan tujuan untuk mengurangi pigmentasi warna oranye pada T. erecta cv. Sudamala Oranye 1 dengan cara mendegradasi senyawa karotenoid secara spesifik pada mahkota bunga dan diharapkan tidak mengubah sifat lain. Transformasi dapat dilakukan apabila serangkaian kegiatan kultur jaringan dalam regenerasi tanaman telah diperoleh, oleh karena itu rangkaian tahapan dalam kultur jaringan dalam meningkatkan efesiensi transformasi regenerasi merupakan hal penting dalam melaksanakan rekayasa genetik tanaman. Penelitian ini memiliki tujuan utama yaitu untuk memodifikasi warna bunga tanaman marigold (T. erecta cv. Sudamala Oranye 1) bunga berwarna oranye menjadi bunga berwarna putih. Tujuan khusus dari penelitian ini adalah (1) memperoleh informasi mengenai media regenerasi tunas dari eksplan daun marigold dengan penambahan zat pengatur tumbuh sitokinin thiadiazuron (TDZ) atau Benzylaminopurine (BAP), (2) memperoleh kandidat tanaman transforman yang membawa gen InMYB1-CCD4? melalui analisis secara molekuler. Percobaan pertama adalah evaluasi respon organogenesis tunas dari eksplan daun marigold terhadap pemberian sitokinin TDZ dan BAP. Percobaan ini dilakukan dari bulan Mei 2021 hingga Mei 2022 di laboratorium kultur jaringan 1, Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian Institut Pertanian Bogor. Hasil percobaan menunjukkan TDZ dengan konsentrasi 0,25 mgL-1 mampu meningkatkan rata-rata jumlah tunas sebanyak 4 tunas dengan persentase eksplan bertunas sebesar 73,3% dan rata-rata jumlah akar sebanyak 1 akar dengan persentase eksplan berakar sebesar 11,1%. Penggunaan sitokinin lain yaitu BAP pada konsentrasi 7 mgL-1 rata-rata menghasilkan 6 tunas dengan persentase eksplan bertunas sebesar 100% dan rata-rata jumlah akar sebanyak 1 akar dengan persentase eksplan berakar sebesar 11,1%. Dari kedua jenis sitokinin yang digunakan, penggunaan BAP lebih efektif dibandingkan TDZ karena dapat menginduksi 100% eksplan tunas dan jumlah tunas kebih banyak. Selain itu, secara morfologi penambahan TDZ membuat daun menjadi abnormal yang disebabkan karena konsentrasi yang tinggi dapat menghambat elongasi tunas sehingga tunas menjadi kerdil dan kualitasnya rendah. Percobaan kedua adalah transformasi genetik gen InMYB1-CCD4? pada marigold (T. erecta cv. Sudamala Oranye 1). Percobaan ini dilakukan pada bulan Juni 2022 hingga April 2023 di Laboratorium kultur jaringan 1, Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian Institut Pertanian Bogor. Percobaan transformasi menghasilkan 6 tanaman putatif transgenik T. erecta cv Sudamala oranye 1 dengan efisiensi transformasi yang dihasilkan adalah 1%, efisiensi regenerasi 29,17%. Hasil analisis PCR menggunakan primer spesifik gen InMYB1-CCD4? dengan ukuran 1200 bp menunjukkan enam dari 17 tanaman putatif transforman positif mengandung gen InMYB1-CCD4?. Pengamatan fenotipik menunjukkan adanya perbedaan antara tanaman kontrol (wild type) dan transforman yaitu daun yang berukuran kecil dan laju pertumbuhan yang lama.

Marigolds (Tagetes erecta) is a floriculture commodity with many benefits, especially as an ornamental plant, cut flower, and industrial raw material. Marigolds have the variety of flower colors, however plant breeders are atill trying to increase the variety of marigold’s flower colors. The alternative method to modify flower colour is genetic engineering. In this research, the genetic engineering of marigold was done by introducing the InMYB1-CCD4? gene into the plant genome to reduce orange pigmentation in Tagetes erecta var. Sudamala Orange 1, specifically degrades carotenoid compounds in the flower and is expected not to change other properties. Transformation can be carried out if a series of tissue culture activities in plant regeneration are established. Therefore, a series of stages in tissue culture to increase the efficiency of regeneration transformation is important in plant genetic engineering. This study aims to modify the flower color of marigold plants (T. Erecta cv. Sudamala Orange 1) from orange to white flowers. The specific objectives of this research include (1) to obtain marigold regeneration media with the addition of cytokinin growth regulators and (2) to obtain candidate transformant plants using the molecular transformation method of the InMYB1-CCD4? gene. The first experiment was the organogenesis response of marigold leaf explants to the cytokinin Thidiazuron (TDZ) and Benzyl Amino Purine (BAP) treatment. This experiment was carried out from May 2021 to May 2022 in tissue culture laboratory 1, Department of Agronomy and Horticulture, Faculty of Agriculture, IPB University. The experimental results show TDZ with a concentration of 0.25 mgL-1 increased the average number of 4 shoots with a percentage of 73.3% and 0 root with a percentage of 0%. Another use of cytokinin is BAP at a concentration of 7 mgL-1, which can produce an average number of 6 shoots with a percentage of 100%, 1 root with percentage of rooted of 11.1%. Of the two types of cytokinin used, the use of BAP is more effective than TDZ because it can 100% induce shoots; apart from that, morphologically, the addition of TDZ makes the leaves abnormal because the high concentration can inhibit shoot elongation so that the shoots become stunted and of low quality. The second experiment was the genetic transformation of InMYB1-CCD4? in marigold (T. erecta cv. Sudamala Orange 1). This experiment was carried out from June 2022 to April 2023 at Tissue Culture Laboratory 1, Department of Agronomy and Horticulture, Faculty of Agriculture, Bogor Agricultural Institute. The transformation experiment produced six putative transgenic plants, T. erecta cv Sudamala orange 1, resulting in a 1% regeneration efficiency of 29.17%. The results of PCR analysis using the specific primer InMYB1-CCD4? with a size of 1200bp showed that six of the 17 putative transformant plants were positive for containing the InMYB1-CCD4? gene. Phenotypic observations showed differences between control plants (wild type) and transformants that have: smaller leaves and slower growth rates.