Telaah Aktivitas Pigmen Prodigiosin dari Bakteri Asal Tanah Rizosfer sebagai Agen Antioksidan

Abstract

Radikal bebas menjadi perhatian khusus bagi sebagian peneliti. Hal ini disebabkan fungsi ganda radikal di dalam tubuh, yang jika dalam kondisi normal akan berfungsi sebagai homeostasis dan jika kondisi berlebih dapat menyebabkan kerusakan biomolekul seperti DNA, lipid, dan protein serta menyebabkan beberapa penyakit degeneratif. Penyakit degeneratif yang berkaitan dengan cekaman okisdatif telah banyak dilaporkan dapat meningkatkan angka mortalitas khususnya di Indonesia. Jumlah radikal bebas didalam tubuh dapat diseimbangkan dengan memberi antioksidan. Sumber antioksidan yang saat ini diminati adalah antioksidan alami yang salah satunya berasal dari pigmen bakteri. Pigmen yang dihasilkan oleh bakteri sangat beragam baik dari warna maupun bioaktvitasnya, diantaranya adalah pigmen merah (prodigiosin) yang memiliki spektrum bioaktivitas yang luas. Salah satu bioaktivitas yang ditelaah pada pigmen merah adalah sebagai antioksidan. Pada penelitian sebelumnya telah berhasil diisolasi bakteri berwarna merah dari tanah rizosfer Rafflesia. Pada penelitian ini empat isolat koleksi dibuktikan mampu memproduksi pigmen merah sebagai senyawa metabolitnya, namun terkait bioaktivitas pigmen merah yang dihasilkan sebagai antioksidan belum pernah dievaluasi. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk menentukan aktivitas pigmen berwarna merah dari bakteri asal tanah rizosfer sebagai agen antioksidan baik secara in vitro maupun di tingkat seluler. Penelitian ini dimulai dengan meremajakan isolat penghasil pigmen dan mengekstraksi pigmen merah baik dari intraseluler maupun ekstraseluler masing-masing secara berurutan dengan pelarut metanol dan kloroform. Ekstrak kasar yang dihasilkan diskrining aktivitas antioksidannya menggunakan radikal 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH). Isolat dengan antioksidan terbaik, dilakukan optimasi pelarut ekstraksinya yang kemudian pelarut optimal akan digunakan untuk ekstraksi selanjutnya. Ekstrak yang memiliki antioksidan terbaik dengan pelarut ekstraksi optimal difraksinasi menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT). Penentuan fase gerak pada proses fraksinasi dilakukan melalui dua tahap yaitu pemilihan dua eluen tunggal terbaik dan penentuan rasio volume kombinasi dua eluen terbaik. Hasil kombinasi eluen terbaik digunakan untuk KLT bioautografi dan KLT preparatif. Analisis KLT bioautografi dilakukan untuk mendapatkan pita fraksi yang memiliki potensi antioksidan. Pita yang memiliki antioksidan selanjutnya akan diisolasi menggunakan KLT preparatif. Fraksi aktif selanjutnya ditentukan nilai IC50 antioksidannya menggunakan metode DPPH. Fraksi dengan antioksidan terbaik dan yang menunjukkan karakter pigmen prodigiosin pada pelat KLT dipilih untuk diuji lebih lanjut. Selanjutnya, evaluasi aktivitas antioksidan ekstrak dan fraksi terpilih pigmen merah dilakukan pada tingkat seluler menggunakan S. pombe. Evaluasi tersebut meliputi uji cekaman oksidatif dengan metode spot dan uji aktivitas mitokondria. Fraksi terpilih pigmen merah selanjutnya dikarakterisasi menggunakan uji presumptive prodigiosin dan dikuantifikasi jumlah prodigiosinnya. Karakterisasi lebih lanjut dilakukan secara structural menggunakan UV-Vis, FTIR dan 1H-NMR. Pendukung karakterisasi tersebut dilakukan juga karakterisasi secara molekuler yaitu analisis gen pigC yaitu gen terkait biosintesis prodigiosin. Empat isolat (RR11, RR16, RR20 dan RR24) penghasil pigmen merah berhasil diidentifikasi berdasarkan gen 16S rRNA menjadi dua spesies yaitu RR11 dan RR16 sebagai Serratia nematodiphila sedangkan RR20 dan RR24 sebagai Serratia marcescens. Hasil delapan ekstrak kasar dari empat isolat didapatkan satu isolat yaitu S. nematodiphila RR16 sebagai penghasil antioksidan terbaik dengan IC50 pigmen merah ekstraseluler sebesar 111.18 µg/ mL. Berdasarkan data optimasi pelarut ekstraksi, pigmen merah ekstraseluler dapat optimal diekstraksi menggunakan pelarut kloroform. Ekstrak kloroform S. nematodiphila RR16 difraksinasi dengan menggunakan fase gerak etil asetat:diklorometan 0,5: 8,5 (v/v) dan didapatkan 19 fraksi dengan enam fraksi aktif sebagai kandidat antioksidan berdasarkan analisis KLT bioautografinya. Enam fraksi aktif diisolasi dan didapatkan fraksi empat (F4, Rf 0.29) dengan aktivitas antioksidan terbiak (IC50 140.31 µg/ mL) serta memiliki penampakan pigmen prodigiosin pada pelat KLT. Ekstrak dan Fraksi dengan aktivitas antioksidan terbaik yang diuji pada tingkat seluler menggunakan S. pombe menunjukkan kemampuan dalam mempertahankan viabilitas sel pada cekaman oksidatif. Ekstrak dan fraksi pigmen merah mampu mempertahankan viabilitas pada konsentrasi terbaik 100 µg/mL (ekstrak kasar) dan 140 µg/mL (fraksi). Selain itu, ekstrak dan fraksi pigmen merah juga mampu menginduksi aktivitas mitokondria. Hal ini menginformasikan bahwa toleransi cekaman oksidatif yang diinduksi oleh ekstrak dan fraksi pigmen merah S. nematodiphila RR16 melalui mitochondrial adaptive ROS signaling. Ekstrak dan fraksi pigmen merah menunjukkan karakter prodigiosin yang ditunjukkan dari hasil positif uji presumptive prodigiosin dan karakter spektrum pada UV-Vis yang berada pada rentang prodigiosin yaitu 539 nm (ekstrak kasar) dan 537 nm (fraksi). Secara struktural yang dianalisis menggunakan FTIR dan 1H-NMR juga menunjukkan bahwa fraksi pigmen merah memiliki karakter prodigiosin. Analisis secara molekuler menunjukkan bahwa S. nematodiphila RR16 memiliki gen pigC parsial yang berhasil diamplifikasi dan dianalisis sebagai prodigiosin-synthesizing transferase.

Free radicals are of particular interest to some researchers. This is due to the dual function of radicals in the body, which in normal conditions will function as homeostasis and in excess conditions can cause damage to biomolecules such as DNA, lipids and proteins and cause various degenerative diseases. Degenerative diseases related to oxidative stress have been widely reported to increase mortality rates, especially in Indonesia. The body's free radicals can be balanced by providing antioxidants. Antioxidant sources currently in demand are natural antioxidants, one of which is derived from bacterial pigments. The pigments produced by bacteria are very diverse in color and bioactivity, including red pigment (prodigiosin), which has a broad spectrum of bioactivity. One of the bioactivities examined in red pigments is as an antioxidant. A previous study successfully isolated red-colored bacteria from Rafflesia rhizosphere soil. In this study, four isolates of the collection were proven to be able to produce red pigments as metabolite compounds. However, the bioactivity of red pigments produced as antioxidants has never been evaluated. Therefore, this study aims to determine the activity of red pigments from rhizosphere soil bacteria as antioxidant agents both in vitro and at the cellular level. This study began by rejuvenating pigment-producing isolates and extracting red pigments from both intracellular and extracellular with methanol and chloroform solvents. The resulting crude extracts were screened for antioxidant activity using the 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical. Isolates with the best antioxidants were optimized for their extraction solvents, and then the optimal solvent will be used for further extraction. Extracts with the best antioxidants activity and optimal extraction solvent were fractionated using thin-layer chromatography (TLC). Determination of the mobile phase in the fractionation process is done through two stages: the selection of the two best single eluents and the determination of the volume ratio of the combination of the two best eluents. The best eluent combination results were used for bioautographic and preparative TLC. Bioautographic TLC analysis was conducted to obtain fraction bands that have antioxidant potential. Antioxidant bands were then isolated using preparative TLC. The active fraction was then determined as the antioxidant IC50 value using the DPPH method. Fractions with the best antioxidant activity and those showing prodigiosin pigment characteristics on the TLC plates were selected for further testing. In addition, the antioxidant activity of extracts and selected fractions of the red pigment was evaluated at the cellular level using S. pombe. The evaluation included a spot oxidative cekaman assay and a mitochondrial activity assay. The selected red pigment fraction was further characterized using the presumptive prodigiosin assay and the amount of prodigiosin was quantified. Further characterization was conducted structurally using UV-Vis, FTIR and 1H-NMR. Supporting this characterization, molecular characterization was also carried out, namely pigC gene analysis, which is a gene related to prodigiosin biosynthesis. Four isolates (RR11, RR16, RR20 and RR24) producing red pigment were successfully identified based on the 16S rRNA gene into two species, namely RR11 and RR16 as Serratia nematodiphila while RR20 and RR24 as Serratia marcescens. The results of eight crude extracts from four isolates obtained one isolate, S. nematodiphila RR16, as the best antioxidant producer with an IC50 extracellular red pigment of 111.18 µg/mL. Extraction solvent optimization data shows that extracellular red pigment can be optimally extracted using chloroform solvent. The chloroform extract of S. nematodiphila RR16 was fractionated using ethyl acetate: dichloromethane 0.5: 8.5 (v/v) mobile phase and obtained 19 fractions with six active fractions as antioxidant candidates based on KLT bioautography analysis. Six active fractions were isolated and obtained fraction four (F4, Rf 0.29) with the best antioxidant activity (IC50 140.31 µg/mL) and had the appearance of prodigiocin pigment on the KLT plate. Extracts and fractions with the best antioxidant activity tested at the cellular level using S. pombe showed the ability to maintain cell viability under oxidative cekaman. Red pigment extracts and fractions maintained viability at the best concentration of 100 µg/mL (crude extract) and 140 µg/mL (fraction). In addition, red pigment extracts and fractions were also able to induce mitochondrial activity. This informs that oxidative cekaman tolerance is induced by extracts and fractions of S. nematodiphila RR16 red pigment through mitochondrial adaptive ROS signaling. The extracts and fractions of red pigment showed prodigiosin characteristics as indicated by the positive results of the presumptive prodigiosin test and the UV-Vis spectrum characteristics that were in the prodigiosin range, namely 539 nm (crude extract) and 537 nm (fraction). The structural analysis by FTIR and 1H-NMR also showed that the red pigment fraction had prodigiosin characteristics. Molecular analysis showed that S. nematodiphila RR16 has a partial pigC gene, which was successfully amplified and analyzed as a prodigiosin-synthesizing transferase.