Potensi Ekstrak Pigmen Kuning Bakteri sebagai Sumber Antioksidan Alami

Abstract

Keanekaragaman yang dimiliki oleh mikrob dapat menghasilkan berbagai senyawa metabolit sekunder yang unik dan menunjukkan perannya dalam bidang industri dan farmakologi. Penggunaan metabolit sekunder seperti pigmen bakteri saat ini menarik perhatian untuk diteliti, karena pigmen bakteri memiliki banyak keunggulan baik dalam produksi maupun aktivitasnya. Bakteri penghasil pigmen dapat ditemukan di berbagai habitat mulai dari laut hingga tanah rizosfer. Pigmen yang disintesis oleh bakteri pada habitat tertentu merupakan bentuk mekanisme adaptasi sel bakteri untuk kelangsungan hidup di dalam habitatnya. Bakteri dapat memproduksi berbagai jenis pigmen seperti melanin, prodigiosin, pyocyanin, violacein, karotenoid, dan lain-lain. Pigmen bakteri telah banyak dilaporkan memiliki aktivitas biologis termasuk antioksidan, antimikroba, antikanker, dan sun protection. Penelitian sebelumnya telah berhasil mengisolasi bakteri penghasil pigmen kuning yang berasal dari tanah rizosfer dan bakteri yang berasosiasi dengan spons. Pigmen dari beberapa bakteri tersebut diduga memiliki potensi sebagai antioksidan. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan menentukan aktivitas antioksidan secara in vitro dari ekstrak pigmen kuning bakteri dan dilanjutkan pada khamir Schizosaccharomyces pombe ARC039 yang digunakan sebagai organisme model. Penelitian ini diawali dengan meremajakan dan mengekstraksi pigmen kuning dari 14 isolat bakteri menggunakan pelarut metanol. Ekstrak yang diperoleh kemudian ditentukan aktivitas antioksidannya menggunakan radikal DPPH. Dua isolat yang memiliki aktivitas antioksidan terbaik diidentifikasi berdasarkan gen 16S rRNA dan kemudian dipilih untuk dianalisis lebih lanjut terkait aktivitas antioksidannya berdasarkan pelarut ekstraksi dan radikal yang berbeda. Ekstrak dari pelarut yang memiliki aktivitas antioksidan terbaik dipilih untuk dilakukan fraksinasi dengan menggunakan metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dan dilanjutkan bioautografi antioksidan. Fraksi aktif yang diperoleh dari uji bioautografi antioksidan kemudian diisolasi menggunakan metode KLT preparatif. Fraksi aktif tersebut kemudian ditentukan aktivitas antioksidannya terhadap radikal DPPH dan ABTS. Ekstrak kasar pigmen dan fraksi aktif terpilih kemudian diuji pada level seluler menggunakan organisme model S. pombe ARC039 untuk mengetahui respon toleransi khamir terhadap cekaman oksidatif (H2O2) dan aktivitas mitokondrianya. Selanjutnya, senyawa metabolit yang terkandung dalam fraksi aktif terpilih dianalisis menggunakan liquid chromatography massspectrophotometry (LC-MS/MS). Analisis aktivitas antioksidan dari 14 isolat bakteri penghasil pigmen kuning menunjukkan bahwa isolat SAB E-3 dan SAB E-6 memiliki aktivitas antioksidan terbaik dalam meredam radikal DPPH. Hasil identifikasi berdasarkan gen 16S rRNA menunjukkan bahwa SAB E-3 memiliki kemiripan dengan Pseudomonas oryzihabitans IAM 1568 (99,37%) dan SAB E-6 memiliki kemiripan dengan Micrococcus aloeverae AE-6 (98,18%). Kedua isolat tersebut kemudian diekstraksi menggunakan beberapa pelarut organik untuk mengetahui pengaruh pelarut ekstraksi terhadap aktivitas antioksidan. Ekstrak kasar pigmen dari kedua isolat yang diekstraksi menggunakan metanol mengandung senyawa fenolik dan flavonoid tertinggi yang mungkin berkontribusi terhadap aktivitas antioksidan. Selain itu, berdasarkan analisis UV-Vis, kedua ekstrak kasar pigmen yang dihasilkan oleh masing-masing bakteri diduga sebagai karotenoid. Ekstrak kasar pigmen dari P. oryzihabitans SAB E-3 dan M. aloeverae SAB E-6 yang diekstraksi menggunakan metanol memiliki aktivitas antioksidan terbaik dalam meredam radikal DPPH dengan nilai IC50 masing-masing sebesar 190,73 µg/mL dan 248,14 µg/mL, sedangkan aktivitas antioksidan terhadap radikal ABTS memiliki nilai IC50 masing-masing sebesar 187,71 µg/mL dan 983,79 µg/mL. Oleh sebab itu, kedua ekstrak ini dipilih untuk dilakukan fraksinasi dan dilanjutkan uji bioautografi. Hasil analisis bioautografi menunjukkan bahwa ekstrak P. oryzihabitans SAB E-3 memiliki lima fraksi aktif dan M. aloeverae SAB E-6 memiliki tiga fraksi aktif. Fraksi 1 dari P. oryzihabitans SAB E-3 memiliki aktivitas antioksidan yang lebih kuat terhadap radikal DPPH (75,71 µg/mL) dibandingkan ekstrak kasar dan fraksi lainnya. Akan tetapi, aktivitas terhadap radikal ABTS lebih rendah (226,59 µg/mL) dibandingkan ekstrak kasar pigmen. Oleh karena itu, fraksi 1 dari P. oryzihabitans SAB E-3 dipilih untuk dilanjutkan pada uji tingkat sel. Konsentrasi terendah dari ekstrak kasar pigmen (50 µg/mL) dan fraksi aktif 1 (18,75 µg/mL) mampu meningkatkan toleransi khamir S. pombe ARC039 terhadap cekaman oksidatif dan menginduksi aktivitas mitokondria. Profil metabolit berdasarkan analisis LCMS/MS menunjukkan bahwa fraksi aktif 1 mengandung senyawa piceatannol, resveratrol, isorhapontigenin, isoliquiritigenin, liquiritin, dan 2-Omethylisohemigossylic acid lacton, yang diduga berkontribusi terhadap aktivitas antioksidan. Oleh karena itu, ekstrak kasar pigmen kuning dan fraksi aktif yang dihasilkan P. oryzihabitans SAB E-3 dan M. aloeverae SAB E-6 berpotensi menjadi sumber antioksidan alami.

The diversity of microbes can produce a variety of unique secondary metabolite compounds and demonstrate their role in industry and pharmacology. The use of secondary metabolites, such as bacterial pigments, is currently the focus of research because bacterial pigments have many advantages in both production and activity. Pigment-producing bacteria can be found in various habitats, ranging from marine to rhizosphere soil. Pigments synthesized by bacteria in specific habitats are a form of bacterial cell adaptation mechanism for survival in their habitat. Bacteria can produce various pigments, such as melanin, prodigiosin, pyocyanin, violacein, carotenoids, and others. Bacterial pigments have been widely reported to exhibit biological activities, including antioxidant, antimicrobial, anticancer, and sun protection. Previous studies have isolated yellow pigmentproducing bacteria from rhizosphere soil and sponge-associated bacteria. Pigments from some of these bacteria are thought to have the potential as antioxidants. Therefore, this study aimed to determine the in vitro antioxidant activity of bacterial yellow pigment extracts and continued on the yeast Schizosaccharomyces pombe ARC039 used as a model organism. This study was initiated by rejuvenating and extracting yellow pigments from 14 bacterial isolates using a methanol solvent. The antioxidant activity of the obtained extracts was then determined using the DPPH radical. The two isolates with the highest antioxidant activity were identified based on the 16S rRNA gene. They were then selected for further analysis of their antioxidant activity based on different extraction solvents and radicals. The extract from the solvent with the best antioxidant activity was chosen for fractionation by thin-layer chromatography (TLC), followed by antioxidant bioautography. The active fraction obtained from the antioxidant bioautography test was isolated using the preparative TLC method. The antioxidant activity of the active fraction was determined against DPPH and ABTS radicals. The selected crude pigment extracts and active fractions were tested at the cellular level using the S. pombe ARC039 model organism to determine the yeast tolerance response to oxidative stress (H2O2) and its mitochondrial activity. In addition, the metabolites contained in the selected active fractions were analyzed using liquid chromatography-mass spectrophotometry (LC-MS/MS). Analysis of the antioxidant activity of 14 isolates of yellow pigmentproducing bacteria showed that isolates SAB E-3 and SAB E-6 had the best antioxidant activity in reducing DPPH radicals. Based on 16S rRNA gene identification, SAB E-3 was similar to Pseudomonas oryzihabitans IAM 1568 (99.37%), and SAB E-6 was similar to Micrococcus aloeverae AE-6 (98.18%). Both isolates were extracted using several organic solvents to determine the effect of the extraction solvent on antioxidant activity. The crude pigment extracts of both isolates extracted with methanol contained the highest phenolic and flavonoid compounds, which may contribute to their antioxidant activity. In addition, based on UV-Vis analysis, the two crude pigment extracts produced by each bacterium were suspected to be carotenoids. Crude extracts of pigments from P. oryzihabitans SAB E-3 and M. aloeverae SAB E-6 extracted with methanol had the best antioxidant activity in reducing DPPH radicals with IC50 values of 190.73 µg/mL and 248.14 µg/mL, respectively, while antioxidant activity against ABTS radicals had IC50 values of 187.71 µg/mL and 983.79 µg/mL, respectively. Therefore, these two extracts were selected for fractionation followed by bioautography tests. The results of the bioautography analysis showed that the extracts of P. oryzihabitans SAB E-3 and M. aloeverae SAB E-6 contained five and three active fractions, respectively. Fraction 1 of P. oryzihabitans SAB E-3 had a stronger antioxidant activity against DPPH radicals (75.71 µg/mL) than the crude extract and other fractions. However, the activity against ABTS radicals was lower (226.59 µg/mL) than that of the crude pigment extract. Therefore, fraction 1 of P. oryzihabitans SAB E-3 was selected for the cellular-level assay. The lowest concentrations of crude pigment extract (50 µg/mL) and active fraction 1 (18.75 µg/mL) were able to increase the tolerance of S. pombe ARC039 to oxidative stress and induce mitochondrial activity. Metabolite profiling based on LC-MS/MS analysis showed that active fraction 1 contained the compounds piceatannol, resveratrol, isorhapontigenin, isoliquiritigenin, liquiritin, and 2-Omethylisohemigossylic acid lactone, which are thought to contribute to the antioxidant activity. Therefore, the crude yellow pigment extract and active fraction produced by P. oryzihabitans SAB E-3 and M. aloeverae SAB E-6 have the potential to be sources of natural antioxidants.