Restriction fragment length polymorphism (RFLP) daerah sitokrom b DNA mitokondria dari tujuh spesies mamalia

Abstract

Indonesia adalah negara yang kaya dengan biodiversitas dan menempati ranking nomor dua setelah negara Brazil. Di Indonesia, satwa liar banyak diburu walaupun dilindungi undang-undang. Selain diburu untuk dipelihara, beberapa satwa liar juga diburu untuk dikonsumsi karena dipercaya sebagai obat untuk beberapa penyakit. Beberapa tahun belakangan ini marak tejadi pemalsuan daging, salah satunya adalah daging sapi dengan daging celeng (babi liar, babi hutan). Daging hewan yang telah dipotong-potong dan dijual di pasar maupun dari hasil penyelundupan terkadang sulit diidentifikasi dari spesies apa daging tersebut berasal jika ciri-ciri morfologinya sudah hilang. Salah satu metode yang dapat digunakan untuk mengetahui data molekuler dan mendeteksi dari spesies apa daging tersebut berasal adalah dengan metode PCR-RFLP berdasarkan daerah sitokrom b dari DNA mitokondria. Metode ini sudah secara luas digunakan untuk identifikasi mamalia, burung, dan reptil. Walaupun sudah digunakan secara luas untuk mengetahui data molekuler hewan, namun identifikasi data molekuler hewan lokal yang ada di Indonesia baru sedikit yang dilakukan, antara lain ayam dan itik. Metode yang digunakan dalam penelitian ini dibagi menjadi pengumpulan sampel, ekstraksi DNA genom, amplifikasi fragmen DNA mitokondria, pemotongan DNA hasil PCR menggunakan enzim Hinf I dan Rsa I, pembacaan hasil menggunakan elektroforesis, dan penghitungan ukuran fragmen DNA. Pengumpulan sampel ketujuh spesies mamalia dilakukan di sekitar Bogor kemudian di dalam larutan DMSO 25 % dan NaCl 4,5 M. Ekstraksi DNA genom dengan metode presipitasi amonium asetat. Selanjutnya dilakukan amplifikasi daerah sitokrom b dengan teknik PCR. Reaksi PCR terdiri dari air milique steril (ddH2O) 16,5 μl, buffer 10X 2,5 μl, MgCl 2 μl, dNTP 2 mM, primer sitokrom b1 L14841 (5’CCATCCAACATCTCAGCATGATGAAA3’) 1 μg, primer sitokrom b2 H15149 (5’CCCCTCAGAATGATATTTGTCCTCA3’) 1 μg, taq polymerase 2,5 unit, dan DNA template ± 100ng sehingga diperoleh volume total 25μl. PCR mix tersebut dimasukkan ke dalam mesin PCR dan dilakukan amplifikasi sebanyak 35 siklus. DNA hasil amplifikasi atau amplikon kemudian dipotong dengan menggunakan enzim restriksi Hinf I (2,5 U) dan Rsa I (20 U). Bahan dan reagen yang dimasukkan dan dicampurkan dalam pemotongan DNA hasil PCR (amplikon) dengan enzim restriksi HinfI secara berurutan adalah 10 μl amplikon ditambahkan air milique steril (ddH2O) 12,25 μl, buffer 10 X 2,5 μl, dan enzim restriksi Hinf I 2,5 U, sehingga volume total menjadi 25 μl, sedangkan bahan dan reagen yang dimasukkan dan dicampurkan dalam pemotongan amplikon dengan enzim restriksi RsaI secara berurutan adalah 10 μl amplikon ditambahkan air milique steril (ddH2O) 10,5μl, buffer 10X 2,5μl, dan enzim restriksi RsaI 20 U sehingga volume total menjadi 25 μl. Amplikon yang dipotong dengan kedua enzim restriksi tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 37 °C selama 2 jam untuk pemotongan dengan enzim restriksi Hinf I dan selama 6 jam untuk pemotongan dengan enzim restriksi Rsa I dengan mesin PCR. Penghitungan ukuran amplikon dan fragmen hasil pemotongan enzim atau fragment restriksi dilakukan dengan mengukur jarak antara migrasi DNA sampel dengan migrasi marka DNA dengan gel agarose masing-masing 1,5 % dan 2 % di atas sinar UV transluminator (260nm). Amplifikasi daerah sitokrom b dengan menggunakan primer L14841/H15149 memakai metode PCR menghasilkan amplikon yang sama pada setiap spesies yaitu sebesar 359 pb. Amplikon sitokrom b DNA mitokondria ketujuh spesies mamalia dipotong dengan menggunakan dua enzim restriksi, yaitu Hinf I dan Rsa I. Enzim restriksi Hinf I yang digunakan hanya dapat menemukan daerah pemotongan amplikon sitokrom b DNA mitokondria pada Sapi FH, kelinci, dan mencit albino, sedangkan empat spesies lainnya yaitu babi, kambing kacang, kucing lokal, dan kancil tidak dapat ditemukan. Enzim restriksi Rsa I yang digunakan tidak dapat menemukan daerah pemotongan sitokrom b pada hampir semua spesies mamalia, kecuali pada spesies mencit albino.