Kajian Klon Pustaka Metagenomik Sebagai Agens Biokontrol Meloidogyne incognita dan Pemacu Pertumbuhan

Abstract

Metagenomik merupakan teknik yang digunakan untuk mengeksplorasi sumber daya kekayaan genetik dari mikrob pada sampel lingkungan. Teknik ini memungkinkan untuk mengetahui potensi genetik dari mikrob pada suatu lingkungan yang dapat dimanfaatkan dalam berbagai hal. Metode ini terdiri atas tahap konstruksi, analisis klon pustaka metagenomik, dan koleksi klon pustaka metagenomik. Analisis klon pustaka metagenomik dari tanaman kakao telah dilakukan dan dapat menginduksi ketahanan tanaman kakao terhadap penyakit VSD (Vascular Streak Dieback). Pendekatan yang sama dapat dilakukan untuk mengetahui potensi dari klon tersebut dalam menekan patogen tanaman lainnya terutama patogen dari kelompok nematoda. Nematoda dari genus Meloidogyne dikenal sebagai penyebab penyakit puru akar pada tanaman pertanian. Patogen ini tersebar luas di berbagai belahan dunia dan dapat menyebabkan kehilangan hasil mencapai 25% dan kerugian ekonomi sebesar 14%. Spesies Meloidogyne yang menyebabkan kerugian secara ekonomi diantaranya M. incognita, M. arenaria, M. hapla, M. javanica, M. chitwoodi, dan M. fallax. Penelitian ini bertujuan memperoleh klon pustaka metagenomik asal tanaman kakao yang dapat menekan keparahan penyakit puru akar oleh nematoda Meloidogyne incognita dan memacu pertumbuhan tanaman. Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Nematologi Tumbuhan, Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan, dan rumah kaca kampus IPB Dramaga. Penelitian dilakukan dalam tujuh tahap, yaitu: (1) pengambilan sampel tanaman yang bergejala puru akar pada tanaman tomat di lapangan, ekstraksi, dan identifikasi morfologi serta perbanyakan M. incognita pada tanaman tomat; (2) rekultivasi klon pustaka metagenomik; (3) pengujian fitotoksik klon pustaka metagenomik terhadap benih dan daya berkecambah benih dengan metode pengujian di atas kertas; (4) pengujian in vitro senyawa bioaktif pustaka metagenomik terhadap mortalitas juvenil 2 M. incognita; (5) pengujian mekanisme antagonisme klon pustaka metagenomik; (6) pengujian rumah kaca keefektifan senyawa bioaktif pustaka metagenomik dalam menekan keparahan penyakit dan pertumbuhan tanaman; (7) identifikasi klon potensial berdasarkan visualisasi DNA plasmid dengan elektroforesis. Tujuh isolat klon pustaka metagenomik asal kakao dapat menyebabkan mortalitas terhadap juvenil 2 (J2) M. incognita secara in vitro dengan persentase mortalitas 96,33%-100%. Mekanisme antagonisme isolat klon pustaka metagenomik yang diduga menyebabkan mortalitas terhadap nematoda yakni dengan menghasilkan enzim protease. Tujuh isolat mampu menghasilkan enzim protease dengan indeks protease berkisar 0,16-0,53. Hasil pengujian fitotoksisitas dari tujuh isolat klon pustaka metagenomik tidak menunjukkan gejala fitotoksik pada bibit mentimun. Hasil pengujian didapatkan indeks vigor berkisar 74 % - 98,67% dan persentase daya berkecambah mencapai 74,67% - 100%. Panjang tajuk dan akar bibit mentimun menunjukkan hasil yang tidak berbeda nyata dengan perlakuan kontrol yang mana membuktikan tidak adanya efek fitotoksik pada bibit mentimun. Senyawa bioaktif dari tujuh klon pustaka metagenomik dapat menekan keparahan penyakit secara in planta. Hasil uji menunjukkan rata-rata jumlah puru akar yang terbentuk lebih sedikit dibandingkan dengan kontrol, yaitu berkisar 53 – 72 puru. Keefektifan penekan puru akar yang dihasilkan tujuh isolat berkisar 33,65% - 54,63%. Skala kerusakan pada akar akibat infeksi nematoda puru akar dapat berkurang, sehingga menghasilkan skala kerusakan berkisar 2,6 -3,6. Tujuh klon pustaka metagenomik mampu memacu pertumbuhan tanaman mentimun. Hal tersebut dapat terlihat dari terjadinya peningkatan parameter pertumbuhan tanaman yang diberi perlakuan senyawa bioaktif pustaka metagenomik dibandingkan tanaman kontrol. Perlakuan isolat PMC8 dan PMS 14 memiliki konsistensi peningkatan bobot segar dan kering tajuk, serta bobot segar dan kering akar terbaik dibandingkan dengan perlakuan lainnya. Tanaman pada perlakuan PMC8 memiliki berat segar dan kering tajuk secara berturut 77,91 g dan 7,75 g, serta bobot segar dan kering akar secara berturut 3,53 g dan 0,35 g. Perlakuan isolat PMS14 menunjukkan hasil berat segar dan kering tajuk secara berturut 79,31 g dan 7,15 g, serta bobot segar dan kering akar secara berturut 2,03 g dan 0,47 g, Visualisasi DNA sisipan pada plasmid klon pustaka metagenomik dilakukan untuk mengkonfirmasi keberadaan DNA sisipan. Hasil visualisasi isolasi DNA plasmid menunjukkan ukuran DNA lebih dari 10.000 pb yang diperkirakan didalamnya terdapat DNA sisipan berukuran lebih dari 7000 pb. Hal tersebut menyebabkan tidak dapat dilakukannya identifikasi DNA sisipan dikarenakan membutuhkan teknik khusus untuk dapat mengamplifikasi DNA panjang tersebut.

Metagenomics is a technique used to explore the genetic resources of microbes in environmental samples. This technique makes it possible to determine the genetic potential of microbes in an environment which can be utilized in various ways. This method consists of the construction stage, analysis of metagenomic library clones, and collection of metagenomic library clones. Metagenomic library clone analysis of cocoa plants has been carried out and can induce resistance of cocoa plants to VSD (Vascular Streak Dieback) disease. The same approach can be used to determine the potential of these clones in suppressing other plant pathogens, especially pathogens from the nematode group. Nematodes from the genus Meloidogyne are known to cause root-knot disease in agricultural plants. This pathogen is widespread in various parts of the world and can cause yield losses of up to 25% and economic losses of 14%. Meloidogyne species that cause economic losses include M. incognita, M. arenaria, M. hapla, M. javanica, M. chitwoodi, and M. fallax. This research aims to obtain metagenomic library clones from cocoa plants that can reduce the severity of root-knot disease caused by the nematode Meloidogyne incognita and stimulate plant growth. This research was carried out in the Plant Nematology Laboratory, Plant Bacteriology Laboratory, and the greenhouse of IPB Dramaga campus. The research was carried out in seven stages, namely: (1) taking samples of plants with root-knot symptoms on tomato plants in the field, extraction, and morphological identification and multiplication of M. incognita on tomato plants; (2) recultivation of metagenomic library clones; (3) testing the phytotoxicity of metagenomic library clones on seeds and seed germination using the test method on paper; (4) in vitro testing of metagenomic library bioactive compounds on 2 M. incognita juvenile mortality; (5) testing the antagonism mechanism of metagenomic library clones; (6) greenhouse testing of the effectiveness of metagenomic library bioactive compounds in suppressing disease severity and plant growth; (7) identification of potential clones based on visualization of plasmid DNA by electrophoresis. Seven metagenomic library clone isolates from cocoa could cause mortality in juvenile 2 (J2) M. incognita in vitro with a mortality percentage of 96,33%-100%. The mechanism of antagonism of metagenomic library clone isolates which is thought to cause nematode mortality is by producing protease enzymes. Seven isolates were able to produce protease enzymes with protease indices ranging from 0,16 to 0,53. The results of the phytotoxicity test of seven metagenomic library clone isolates did not show phytotoxic symptoms in cucumber seedlings. The test results showed that the vigor index ranged from 74% - 98,67% and the germination percentage reached 74,67% - 100%. The length of the shoot and roots of cucumber seedlings showed results that were not significantly different from the control treatment, which proves that there is no phytotoxic effect on cucumber seedlings. Bioactive compounds from seven metagenomic library clones can suppress disease severity in planta. The test results showed that the average number of root knots formed was less than the control, namely around 53 – 72 galls. The effectiveness of root-knot suppressants produced by seven isolates ranged from 33,65% - 54,63%. The scale of damage to roots due to root-knot nematode infection can be reduced, resulting in a damage scale ranging from 2,6 to 3,6. Seven metagenomic library clones were able to stimulate the growth of cucumber plants. This can be seen from the increase in growth parameters of plants treated with metagenomic library bioactive compounds compared to control plants. The PMC8 and PMS 14 isolate treatments had the best consistent increase in fresh and dry weight of shoots, as well as fresh and dry weight of roots compared to other treatments. Plants in the PMC8 treatment had shoot fresh and dry weights of 77,91 g and 7,75 g respectively, and root fresh and dry weights of 3,53 g and 0,35 g respectively. The PMS14 isolate treatment showed shoot fresh and dry weights of 79,31 g and 7,15 g respectively, and root fresh and dry weights of 2,03 g and 0,47 g respectively. Visualization of inserted DNA in metagenomic library clone plasmids was carried out to confirm the presence of inserted DNA. The visualization results of plasmid DNA isolation show a DNA size of more than 10.000 bp which is estimated to contain inserted DNA measuring more than 7000 bp. This makes it impossible to identify the inserted DNA because it requires a special technique to amplify the long DNA.