Identification of Aphids on Banana Plants and the Effect of Banana bunchy top virus on the Life Cycle and Fecundity of Aphids

Abstract

Banana bunchy top disease (BBTD) stands out as a significant threat to banana plants in Indonesia, capable of causing a complete yield loss of up to 100%. Pentalonia nigronervosa and Pentalonia caladii (Hemiptera: Aphididae) have been identified as vectors persistently transmitting the Banana bunchy top virus (BBTV). Previous studies have documented the infestation of these aphid species on banana plants in the provinces of West Java, East Java, and Central Java. Consequently, there was a need for a comprehensive survey to assess the prevalence of aphids on banana plants throughout Indonesia, followed by the identification of aphid species. Beyond transmitting viruses from one plant to another, intricate interactions exist between aphids and the viruses they carry, manifesting in a shorter life cycle for vector insects and heightened fecundity. These dynamics enhance the potential of vectors to disseminate BBTV. This research aimed (1) to identify aphid species on banana plants using eleven morphometric characters and the sequence of partial mtCO-I gene and (2) to determine the effect of BBTV-infected plants on the life cycle and fecundity of aphids. The research activities were conducted in two phases. The first phase involved morphometric and molecular identification of aphids from July to December 2022. The second phase, focusing on the effects of BBTV-infected plants on the life cycle and fecundity of aphids, was executed from January to May 2023. The study was conducted at the Insect Biosystematics Laboratory, Plant Virology Laboratory, Cikabayan Greenhouse, Department of Plant Protection, Faculty of Agriculture, Bogor Agricultural University. Aphid samples were collected from several banana cultivars including Mas, Ketip, Muli, Cavendish, Ambon, Kepok, Randah, Pinang, Awak, and the wild banana, Musa acuminata from four provinces in Indonesia, namely Bali, West Kalimantan, North Kalimantan, and East Kalimantan. Morphological and morphometric identification of aphids using the permanent slide preparation method from Blackman and Eastop (2000). Identification of aphids was pursued up to the species level. Eleven morphometric characters were measured: length of body, head width, antennal length, length of antennal segment I-II, length of antennal segment III-V, length of antennal segment VI, length of ultimate rostrum segment, length of siphunculus, length of femur, length of tibia and length of caudal. Molecular identification begins with the DNA extraction process for total aphids followed by the method proposed by Goodwin et al. (1994) with modifications in the final stage, involving resuspension with a 10 μl solution of ddH2O. The obtained total DNA from aphids served as a template for the mtCO-I gene amplification stage, employing universal primers LCO1490 (5'-GGTCAACAAATCATAAAGAATT-GG-3') and HCO2198 (5'-TAAACTTCAG GGTGACCAAAAAATCA-3') as forward and reverse primers, respectively, with an amplicon target measuring 710 bp. The amplification of the target DNA underwent denaturation, annealing (primary attachment), and elongation (synthesis of new DNA strands) stages. Subsequently, the amplification product was visualized through 1% agarose gel electrophoresis. Successfully amplified samples were then forwarded to a service provider for the sequencing stage. Data related to the measurement of morphometric characters in aphids were tabulated using Microsoft Excel 365, employing t-test and PCA (Principal Component Analysis) for analysis. The molecular data were analyzed using Geneious Prime software, involving the alignment of nucleotide sequences from aphid samples with those of other insects published in GenBank. The BLAST (Basic Local Alignment Search Tools) program executed the comparison. The nucleotide sequence identity matrix was calculated and visualized using the demarcation tool software (SDTv1.2). Phylogenetic analysis was conducted using Mega application version 11, Identified species deposited to GenBank via the DNA Data Bank of Japan (DDBJ). The effect of BBTV-infected plants on the life cycle and fecundity of aphids comprised several stages, including sampling, morphological identification, aphids rearing, and observation. The observations were carried out using a complete randomized design with four treatment levels; P1: viruliferous P. nigronervosa, P2: non-viruliferous P. nigronervosa, P3: viruliferous P. caladii, and P4: non-viruliferous P. caladii. Each treatment was replicated 50 times, resulting in 200 experimental units. Data analysis utilized the Kruskal-Wallis non-parametric test, and the Mann-Whitney Posthoc test would be performed at a 5% significance level. The study's results confirmed, both morphometrically and molecularly, the presence of two distinct species: P. nigronervosa and P. caladii. Morphometric analysis, utilizing t-tests, identified significant differences in length of body, head width, antennal length, length of antennal segments I-II, length of antennal segments III-V, length of antennal segment VI, length of ultimate rostrum segment (URS), length of siphunculus, length of femur, and length of caudal effectively distinguishing between the two species. Molecular identification through GenBank affirmed that P. nigronervosa from Bali and Kalimantan exhibited 100% homology with P. nigronervosa from Indonesia, Canada, and India. Similarly, P. caladii from Kalimantan demonstrated 98% homology with P. caladii aphids from India and Pentalonia sp from Nigeria. This study underscores the variations in morphometric and molecular characteristics between P. nigronervosa and P. caladii. The research results also indicate that the distribution of P. nigronervosa was only found on banana plants with AA/AAA genomes, particularly in Bali Province, while in Kalimantan, two aphid species, P. nigronervosa and P. caladii, were found with more diverse banana genomes. Furthermore, the morphometric measurement comparison proves that P. nigronervosa found on banana plants with AA/AAA genomes has morphometric characteristics longer than those with BB genomes. For example, P. nigronervosa found in the cv. Cavendish has a longer body, antennal, URS, and tibia compared to bananas with BB genomes. This study indicates a feeding preference in aphids, affecting their morphometric sizes. In general, the life cycle of P. nigronervosa was shorter compared to P. caladii. Additionally, viruliferous aphids exhibited a shorter life cycle than non-viruliferous aphids. The shortest life cycles, in consecutive order, were viruliferous P. nigronervosa with an average of 25.54 days, non-viruliferous P. nigronervosa 29.50 days, viruliferous P. caladii 31.26 days, and non-viruliferous P. caladii 33.96 days. Further analysis indicates that the fecundity of viruliferous and non-viruliferous P. nigronervosa was 34.22 and 19.64 nymphs, respectively. On the other hand, the fecundity of viruliferous and non-viruliferous P. caladii was 25.80 and 19.33 nymphs, respectively. These results suggest that the fecundity of P. nigronervosa is higher than that of P. caladii. Moreover, viruliferous aphids exhibited higher fecundity compared to their non-viruliferous aphids. Banana plants infected with BBTV lead to a shortened life cycle and increased fecundity in both P. nigronervosa and P. caladii. This indicated the potential of the aphids as a vector in spreading BBTV. Therefore, observing the life cycle and fecundity of the aphids on BBTV-infected plants on a field scale needs further investigation to understand its potential in BBTV transmission. This information can be used to control BBTV in Indonesia.

Banana bunchy top disease (BBTD) merupakan salah satu penyakit penting pada tanaman pisang di Indonesia. Penyakit ini dapat menurunkan hasil produksi hingga 100%. Pentalonia nigronervosa dan Pentalonia caladii (Hemiptera: Aphididae) telah dilaporkan sebagai serangga vektor Banana bunchy top virus (BBTV) yang ditularkan secara persisten. Penelitian sebelumnya melaporkan bahwa spesies kutudaun ini telah menyerang tanaman pisang di Provinsi Jawa Barat, Jawa Timur dan Jawa Tengah. Oleh karena itu, perlu dilakukan survei yang lebih luas untuk mengetahui keberadaan kutudaun pada tanaman pisang di Indonesia dan dilanjutkan dengan identifikasi spesies kutudaun. Selain menularkan virus dari satu tanaman ke tanaman lain, terdapat interaksi antara kutudaun dengan virus yang dibawanya seperti siklus hidup serangga vektor yang semakin singkat dan fekunditas yang tinggi sehingga meningkatkan potensi vektor dalam menyebarkan BBTV. Penelitian ini bertujuan (1) mengidentifikasi spesies kutudaun pada tanaman pisang berdasarkan sebelas karakter morfometrik dan berdasarkan urutan sebagian gen mtCOI dan (2) mengetahui pengaruh tanaman terinfeksi BBTV terhadap siklus hidup dan fekunditas kutudaun. Kegiatan penelitian dilaksanakan dalam dua tahap, yaitu identifikasi kutudaun secara morfometrik dan molekuler dilaksanakan pada bulan Juli hingga Desember 2022, sedangkan pengaruh tanaman terinfeksi BBTV terhadap siklus hidup dan fekunditas kutudaun dilaksanakan pada bulan Januari hingga Mei 2023. Penelitian dilakukan di Laboratorium Biosistematika Serangga, laboratorium Virologi Tumbuhan, Rumah Kaca Cikabayan Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Sampel kutudaun berasal dari empat provinsi di Indonesia, yaitu Provinsi Bali, Kalimantan Barat, Kalimantan Utara dan Kalimantan Timur pada beberapa jenis kultivar pisang, diantaranya kultivar Mas, Ketip, Muli, Cavendish, Ambon, Kepok, Randah, Pinang, Awak dan pisang liar yaitu Musa acuminata. Preparat permanen kutuduan disiapkan untuk identifikasi morfologi dan morfometrik mengikuti metode Blackman dan Eastop (2000). Identifikasi kutudaun dilakukan sampai tingkat spesies. Pengukuran morfometri dilakukan pada 11 karakter yaitu panjang tubuh, lebar kepala, panjang antena, panjang antena ruas I-II, panjang antena ruas III-V, panjang antena ruas VI, panjang rostrum ruas terakhir, panjang sifunkuli, panjang femur, panjang tibia dan panjang cauda. Identifikasi molekuler diawali dengan tahapan ektsraksi DNA total kutudaun menggunakan metode dari Goodwin et al. (1994) yang dimodifikasi pada tahap akhir diresuspensikan dengan 10 μl larutan ddH2O. DNA total kutudaun yang diperoleh digunakan sebagai template untuk tahap amplikasi gen mtC01 menggunakan primer universal, yaitu LCO1490 (5’-GGTCAACAAATCATAAA GAATTGG-3’) dan HCO2198 (5’-TAAACTTC AGGGTGACCAAAAAATCA-3’) berturut-turut sebagai forward dan reverse primer dengan target amplikon berukuran 710 bp. Amplikasi DNA target dilakukan dengan tahapan denaturasi, annealing (penempelan primer) dan elongasi (sintesis untaian DNA baru). Selanjutnya produk amplifikasi divisualisasi pada 1% gel agarosa elektroforesis. Sampel yang telah berhasil diamplifikasi kemudian dikirim ke penyedia jasa untuk tahap sekuensing.Data hasil pengukuran karakter morfometrik kutudaun ditabulasi menggunakan Microsoft Excel 365 dengan menggunakan uji t-test dan analisis PCA (Principal Component Analisis). Data molekuler, dianalisis menggunakan perangkat lunak Geneious prime, yaitu penjajaran (alignment) runutan nukleotida sampel kutudaun dengan serangga lain yang telah dipublikasikan di GenkBank dan dibandingkan menggunakan program BLAST (Basic Local Alignment Search Tools). Matriks identitas urutan nukleotida dihitung dan divisualisasikan menggunakan perangkat lunak Demarcation tool (SDTv1.2). Analisis filogenetik dilakukan menggunakan aplikasi Mega versi 11, Spesies yang teridentifikasi disimpan ke GenBank melalui DDBJ (DNA Data Bank of Japan). Pengujian pengaruh tanaman terinfeksi BBTV terhadap siklus hidup dan fekunditas kutudaun dilakukan dengan beberapa tahapan, diantaranya pengambilan sampel, identifikasi morfologi, perbanyakan dan pengamatan kutudaun. Pengamatan menggunakan rancangan acak lengkap yang terdiri dari empat taraf perlakuan, meliputi; P1: P. nigronervosa viruliferus, P2: P. nigronervosa non-viruliferus, P3: P. caladii viruliferus dan P4: P. caladii non-viruliferus. Setiap perlakuan diulang sebanyak 50 ulangan sehingga terdapat 200 unit satuan percobaan. Data dianalisis dengan uji non parametrik Kruskal-Wallis dan Posthoc Mann-Whitney pada taraf 5%. Berdasarkan hasil penelitian, terkonfirmasi dua spesies yang berhasil diidentifikasi secara morfometrik dan molekuler, yaitu P. nigronervosa dan P. caladii. Karakter morfometrik yang membedakan antara kedua spesies berdasarkan uji t-test yaitu panjang tubuh, lebar kepala, panjang antena, panjang antena segmen I-II, panjang antena segmen III-V, panjang antena segmen VI, panjang rostrum segmen terakhir, panjang sifunkuli, panjang femur, dan panjang cauda. Identifikasi molekuler dari GenBank mengkonfirmasi bahwa P. nigronervosa asal Bali dan Kalimantan yang telah diidentifikasi memiliki homologi sebesar 100% dengan kutudaun P. nigronervosa dari Indonesia, Kanada dan India, sedangkan P. caladii asal Kalimantan memiliki homologi 98% dengan kutudaun P. caladii asal India dan Pentalonia sp. asal Nigeria. Penelitian ini memberikan informasi bahwa P. nigronervosa dan P. caladii memiliki variasi karakter morfometrik dan molekuler yang dapat menjadi pembeda dari kedua spesies. Hasil penelitian ini juga menunjukkan bahwa sebaran P. nigronervosa hanya ditemukan pada tanaman pisang bergenome AA/AAA khususnya di Provinsi Bali, sedangkan di Kalimantan ditemukan dua spesies kutudaun yaitu P. nigronervosa dan P. caladii dengan genome pisang yang lebih bervariasi. Lebih lanjut pada perbandingan hasil pengukuran morfometrik membuktikan bahwa P. nigronervosa yang ditemukan pada tanaman pisang dengan genome AA/AAA memiliki karakter morfometrik yang lebih panjang dari pisang dengan genome BB. Sebagai contoh, P. nigronervosa yang ditemukan pada cv. Cavendish memiliki karakter tubuh, antena, URS, dan tibia yang lebih panjang dari pisang dengan genome BB. Hasil penelitian ini mengindikasikan adanya preferensi makan pada kutudaun dan hal tersebut memengaruhi ukuran morfometriknya. Secara umum, siklus hidup P. nigronervosa lebih singkat dibandingkan P. caladii. Selain itu, kutudaun viruliferus menunjukkan siklus hidup lebih singkat dibandingkan kutudaun non-viruliferus. Siklus hidup paling singkat yaitu berturut-turut P. nigronervosa viruliferus dengan rata-rata 25,54 hari, P. nigronervosa non-viruliferus 29,50 hari, P. caladii viruliferus 31,26 hari, dan P. caladii non-viruliferus 33,96 hari. Analisis lebih lanjut menunjukkan bahwa fekunditas P. nigronervosa viruliferus dan non-viruliferus berturut-turut 34,22 dan 19,64 nimfa. Sedangkan fekunditas P. caladii viruliferus dan non-viruliferus yaitu berturut-turut 25,80 dan 19,33 nimfa. Hasil ini menunjukkan bahwa fekunditas P. nigronervosa lebih tinggi dibandingkan P. caladii. Selain itu, kutudaun viruliferus menunjukkan fekunditas yang lebih tinggi dibandingkan kutudaun non-viruliferus. Tanaman pisang yang terinfeksi BBTV menyebabkan siklus hidup semakin singkat dan fekunditas yang tinggi baik P. nigronervosa maupun P. caladii. Hal tersebut menunjukkan potensi kutudaun sebagai vektor dalam menyebarkan BBTV. Oleh karena itu, pengamatan siklus hidup dan fekunditas kutudaun pada tanaman yang terinfeksi BBTV dalam skala lapangan perlu diteliti lebih lanjut untuk mengetahui potensinya dalam menyebarkan BBTV, sehingga dapat menjadi strategi dalam pengendalian penyakit kerdil pisang di Indonesia.