| dc.description.abstract | Radikal bebas merupakan salah satu penyebab penyakit degeneratif pada manusia. Antioksidan adalah senyawa yang mampu memblok reaksi oksidatif akibat radikal bebas yang salah satunya dapat ditemukan pada tumbuhan obat. Girang (Leea indica (Burm. f.) Merr.) merupakan salah satu tumbuhan obat yang tumbuh di Indonesia dengan berbagai macam khasiat kesehatan. Khasiat tersebut karena kandungan berbagai macam senyawa bioaktif yang berperan sebagai antioksidan. Namun, untuk mengisolasi senyawa bioaktif tersebut diperlukan biomassa dalam jumlah besar dan pertumbuhan tanaman yang lama. Kemampuan bakteri endofit dalam menghasilkan senyawa bioaktif yang mirip dengan inangnya, pertumbuhan bakteri yang lebih cepat, dan kemampuan memproduksi senyawa bioaktif yang variatif dibandingkan inangnya menjadi solusi terhadap hal tersebut. Potensi bakteri endofit daun girang dalam menghasilkan antioksidan dipelajari secara intensif untuk menjadi peluang sebagai sumber antioksidan baru yang dapat digunakan dalam bidang kesehatan.
Penelitian ini diawali dengan mengisolasi bakteri endofit dari daun girang. Isolat yang diperoleh dikarakterisasi secara makroskopi, mikroskopi, dan biokimia. Isolat kemudian dilakukan penapisan kemampuan aktivitas antioksidannya berdasarkan persen inhibisi menggunakan radikal 2,2-diphenyl-1-picrylhidrazyl (DPPH). Isolat terseleksi dengan persen inhibisi terbaik selanjutnya diproduksi senyawa bioaktifnya menggunakan medium tryptic soy broth (TSB) dengan waktu inkubasi selama 3 hari dan diekstraksi menggunakan pelarut yang berbeda polaritasnya (n-heksana, etil asetat, dan n-butanol). Masing-masing ekstrak kasar bakteri diuji nilai aktivitas antioksidannya berdasarkan nilai inhibition concentration 50 (IC50), dan total kandungan fenolik dan flavonoidnya. Ekstrak kasar dengan nilai IC50 terbaik selanjutnya dipilih untuk difraksinasi senyawa bioaktifnya menggunakan metode kromatografi lapis tipis (KLT) serta uji bioautografi antioksidan. Fraksi aktif yang mengandung antioksidan pada ekstrak terpilih kemudian diisolasi menggunakan metode KLT preparatif dan dihitung nilai IC50nya. Fraksi aktif dengan nilai IC50 terbaik selanjutnya dianalisis senyawa bioaktif penyusunnya menggunakan kromatografi cair-tandem spektrometri masa (KC-SM/SM). Identifikasi isolat potensial dilakukan menggunakan gen 16S rRNA dan dibuat konstruksi pohon filogenetiknya. Selain itu, dilakukan analisis keragaman bakteri endofit dari daun girang menggunakan next generation sequencing (NGS).
Sebanyak 51 isolat bakteri endofit berhasil diisolasi dari daun girang dengan 11 tipe koloni yang berbeda dan didominasi dengan tipe-1 (21,57%). Isolat bakteri terdiri dari 44 isolat (86%) bersifat Gram-negatif, dan tujuh isolat (14%) bersifat Gram-positif. Uji patogenisitas menunjukkan sebanyak 13,72% isolat bersifat patogen terhadap mamalia dan 10% isolat bersifat patogen terhadap tumbuhan. Isolat nonpatogen pada mamalia dan tumbuhan selanjutnya dilakukan penapisan berdasarkan persen inhibisi menggunakan radikal DPPH. Hasil penapisan diperoleh
sebanyak lima isolat memiliki persen inhibisi lebih dari 80% yaitu isolat DT12, DT23, DM2, BT2, dan BT4.
Hasil rendemen ekstrak dari lima isolat terpilih yang diekstraksi dengan berbagai pelarut didapatkan bahwa ekstrak BT2 n-butanol memiliki jumlah rendemen tertinggi sebesar 0,131% (b/v). Aktivitas antioksidan pada ekstrak dihitung berdasarkan nilai IC50. Ekstrak DT12 etil asetat, ekstrak DT23 dan BT4 n- butanol memiliki aktivitas antioksidan terbaik dengan nilai IC50 berturut-turut sebesar 16,98 μg/mL; 32,83 μg/mL; dan 59,02 μg/mL. Kandungan total fenol dan flavonoid dari ketiga ekstrak terpilih tersebut masing-masing sebesar 107,81 mg ekuivalen asam galat per gram ekstrak (EAG/g ekstrak) dan 42 mg ekuivalen kuersetin per gram esktrak (EK/g ekstrak); 79,80 mg EAG/g ekstrak dan 40,25 mg EK/g ekstrak; 31,41 mg EAG/g ekstrak dan 4,69 mg EK/g ekstrak. Berdasarkan hasil perhitungan, dapat dibuktikan bahwa kandungan total fenol dan flavonoid memiliki korelasi positif dengan aktivitas antioksidan.
Hasil uji bioautografi menunjukkan bahwa ekstrak DT12 etil asetat memiliki sembilan fraksi aktif antioksidan, sedangkan ekstrak DT23 dan BT4 n-butanol masing-masing memiliki sebanyak 4 dan 3 fraksi aktif antioksidan. Fraksi aktif antioksidan tersebut selanjutnya diisolasi dengan KLT preparatif dan diuji kembali nilai aktivitas antioksidannya (IC50). Nilai IC50 menunjukkan bahwa fraksi-15 pada ekstrak DT12 etil asetat memiliki aktivitas antioksidan terbaik dibandingkan fraksi- fraksi aktif lainnya. Selanjutnya, fraksi-15 dari ekstrak DT12 etil asetat dianalisis dengan LC-MS/MS untuk memperoleh senyawa putatif dominannya. Senyawa putatif yang paling dominan berdasarkan lima puncak kromatogram tertinggi berturut-turut ialah dimethylmatairesinol, 13-docosenamide, sphinganine, pipericine, dan octadecanamide yang diketahui memiliki aktivitas antioksidan.
Identifikasi dari tiga isolat terpilih dengan aktivitas antioksidan terbaik yaitu DT12, DT23, dan BT4 berdasarkan gen 16S rRNA diketahui bahwa masing-masing isolat tersebut berkerabat dekat dengan bakteri Paenibacillus cineris LMG 18439, Proteus mirabilis JCM 1669, dan Bacillus tequilensis 10b. Ketiga jenis bakteri tersebut merupakan endofit pada daun girang. Hal ini terkonfirmasi melalui analisis metagenom menggunakan NGS, Paenibacillus dan Bacillus mendominasi terbanyak ke-3 dan ke-6 dari seluruh genus mikrob yang terdapat pada daun girang. Proteus terdapat pada daun girang dengan kelimpahan sebesar 1%.
Berdasarkan kajian literatur, belum ada laporan mengenai bakteri endofit penghasil antioksidan dari daun girang hingga saat ini. Melalui studi ini, berhasil diisolasi tiga bakteri endofit dari daun girang dengan aktivitas antioksidan terkuat, yaitu Paenibacillus cineris DT12, Proteus mirabilis DT23, dan Bacillus tequilensis BT4. Aktivitas antioksidan terkuat pada ke-3 bakteri tersebut ditentukan berdasarkan nilai IC50 baik pada ekstrak kasar maupun fraksi aktifnya. Selain itu, studi ini juga berhasil mengidentifikasi jenis senyawa putatif dominan dari ekstrak terpilih yang memberikan efek antioksidan. Hasil yang diperoleh tersebut menjadi unsur kebaruan yang akan menambah khasanah ilmu pengetahuan tentang antioksidan dari senyawa bioaktif asal bakteri endofit daun girang yang dapat dijadikan peluang sebagai sumber antioksidan baru dan dikembangkan dalam bidang kesehatan. | id |
