Imunostimulan dan Antiinflamasi Metabolit Ekstraseluler Bakteri Probiotik Lactobacillus plantarum Indigenous Indonesia

Abstract

Inflamasi merupakan respon tubuh akibat terjadinya infeksi virus maupun bakteri serta cidera pada tubuh. Inflamasi tersebut dapat mengaktifkan respon imun dalam meningkatkan kemokin dan sitokin antiinflamasi. Sel antigen presenting (APC) yang ada di dalam tubuh akan mendeteksi penginduksi inflamasi melalui mekanisme fagositosis berupa makrofag dan sel dendritik. Sel APC akan mengaktifkan sel T Cluster of Differentiation 4+ (CD4+) dan Cluster of Differentiation 8+ (CD8+) pada kelenjar getah bening. Sel T CD4+ dan CD8+ berfungsi sebagai aktivasi produksi antibodi serta dapat membunuh sel secara langsung. Aktivasi sistem imun dapat memicu terbentuknya protein proinflamasi seperti interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor-α (TNF-α), IL-1β, IL-8, IL-12, IP10, MIP1A dan MCP1. Produksi protein proinflamasi yang berlebih akan menyebabkan terjadinya peningkatan kadar sitokin proinflamasi dalam plasma. Kadar sitokin yang tinggi dalam plasma akan menyebabkan terjadinya “Cytokine storm”. Adanya “badai sitokin” di dalam tubuh menunjukkan terjadinya respon inflamasi yang tidak terkontrol maupun berlebih. Inflamasi akan menyebabkan respon imun pada tubuh untuk pengaktifkan sitokin dalam memproduksi nitrit oksida (NO) sehingga konsentrasi NO menjadi meningkat. Stimulasi dari respon inflamasi dan sistem imun dapat dilakukan dengan penggunaan probiotik galur Lactobacillus. Bakteri probiotik dapat menurunkan sitokin yang berperan pada terbentuknya sel inflamasi dan penurunan sistem imun melalui jalur faktor trankripsi NF-KB. Lactobacillus dapat menginduksi respons imun melalui proses tolerogenik sel dendritik. L. plantarum memiliki potensi untuk dijadikan kandidat terapi dalam pengobatan inflamasi dan respon sistem imun. Oleh karena itu, perlu dikaji potensi bioaktivitas dari L. plantarum indigenous Indonesia sebagai imunostimulan dan antiinflamasi. L. plantarum Su-ls29, L. plantarum Su-ls52, dan L. plantarum Su-ls53 merupakan bakteri probiotik unggul asli Indonesia. Ketiga bakteri tersebut memiliki karakteristik bakteri probiotik unggul antara lain bersifat resistansi asam, dan antimikroba, serta memiliki aktivitas antagonis terhadap bakteri patogen. Belum terdapat penelitian sebelumnya terkait aktivitas imunostimulan dan antiinflamasi dari ketiga bakteri tersebut. Penelitian lebih lanjut perlu dilakukan untuk mengungkap potensi L. plantarum indigenous sebagai imunostimulan dan antiinflamasi. Pada penelitian ini pengujian aktivitas imunostimulan dan antiinflamasi dari metabolit probiotik L. plantarum terhadap mouse makrofag cell line RAW 264.7 secara in vitro. Penentuan galur bakteri dengan aktivitas terbaik dilakukan berdasarkan pada konsentrasi sitokin IL-6, IL-1β, NO, dan TNF-α. Profil metabolit dilakukan pada penelitian ini menggunakan GC-MS dan UHPLC-MS/MS. Metabolit ekstraseluler yang teridentifikasi akan dilakukan simulasi secara in silico dengan metode penambatan molekul dan simulasi dinamika molekuler. Bakteri probiotik sangat sensitif terhadap kondisi lingkungan serta memiliki ketahanan yang rendah untuk tumbuh di dalam produk. Teknik enkapsulasi dapat digunakan sebagai solusi untuk mengatasi masalah sintas bakteri probiotik yang rendah pada saluran cerna. Metode emulsi merupakan enkapsulasi dalam bentuk suspensi hidrokoloid yang mengandung mikroorganisme. Metode ini lebih mudah diaplikasikan serta biaya yang diperlukan tidak terlalu besar. Emulsi tidak menggunakan suhu yang tinggi pada saat pembuatan sehingga dapat mempertahankan viabillitas dari mikroorganisme yang akan dienkapsulasi. Isolat protein kedelai (SPI) dengan variasi konsentrasi digunakan pada pembuatan mikroemulsi. Konsentrasi SPI yang digunakan adalah 0,5%, 1%, dan 2%. Formula mikroemulsi yang dibuat kemudian dievaluasi karakteristik droplet emulsi, stabilitas dan kinetika sel. Hasil penelitian menunjukkan L. plantarum Su-ls29, L. plantarum Su-ls52, dan L. plantarum Su-ls53 merupakan bakteri indigenous Indonesia yang memiliki potensi sebagai imunostimulan dan bersifat non-sitotoksik berdasarkan pada data viabilitas sel. Berdasarkan pada hasil penelitian metabolit L. plantarum Su-ls29 memiliki aktivitas terbaik sebagai imunostimulan terhadap sel RAW 264.7 dibandingkan dengan kontrol sel RAW dengan memiliki kadar NO yang lebih tinggi. Sampel metabolit L. plantarum Su-ls29 teridentifikasi sebanyak 10 metabolit. Prediksi secara in silico dari 10 metabolit dari L. plantarum Su-ls29 menunjukkan senyawa (8aS)-3-hidroksi-3-metil-6,7,8,8a- tetrahidro-2H-pirrolo[1,2-a]pirazina-1,4-dion memiliki aktivitas terbaik dalam inhibisi protein proinflamasi IL-1β, dan IL-6. Metabolit L. plantarum Su-ls29-susu skim memiliki aktivitas antiinflamasi yang terbaik dibandingkan dengan L. plantarum Su-ls29-MRSB berdasarkan pada produksi NO sel makrofag RAW264.7 terinduksi LPS. Konsentrasi metabolit L. plantarum Su- ls29- susu skim 6,25 μg/mL merupakan konsentrasi terbaik dalam aktivitas penurunan NO tertinggi. L. plantarum Su-ls29-susu skim dapat menurunkan ekspresi produksi sitokin IL-1β, IL-6, dan TNF-α pada sel RAW 264.7. Nilai konsentrasi terbaik dari sampel metabolit yang dapat menurunkan produksi sitokin IL-1β, IL-6, dan TNF-α secara berturut-turut adalah 12,5 μg/mL, 25 μg/mL, dan 100 μg/mL. Berdasarkan pada identifikasi metabolit dihasilkan sebanyak 9 metabolit yang teridentifikasi pada metabolit L. plantarum Su-ls29- susu skim dan 14 metabolit yang teridentifikasi pada L. plantarum Su-ls29-MRSB. Metabolit asam 2-[karbamimidoil(metil)amino]asetat, (3R)-3-asetiloksi-4-(trimetilazaniumil)butanoat, serta (3R)-3-hidroksi-4- (trimetilazaniumil)butanoat diduga memiliki peranan dalam aktivitas L. plantarum Su- ls29-susu skim sebagai antiinflamasi. Bakteri probiotik L. plantarum Su-ls29 dibuat dalam bentuk sediaan mikroemulsi dengan menggunakan SPI. Karakterisitik sediaam mikroemulsi terbaik terdapat pada konsentrasi SPI 1% berdasarkan pada data scanning electron microscope. Formula SPI 1% memiliki rerata distribusi ukuran partikel adalah 11,1 μm. Ketiga formula mikroemulsi menunjukkan stabilitas enkaspulasi yang baik berdasarkan pada nilai pH dan viskositas selama periode waktu simpan 40 hari.

Inflammation is the body's response due to viral or bacterial infections and injury to the body. The inflammation can activate the immune response in increasing chemokines and anti-inflammatory cytokines. Antigen presenting cells (APC) in the body will detect inflammatory inducers through phagocytosis mechanisms in the form of macrophages and dendritic cells. APC cells will activate Cluster of Differentiation 4+ (CD4+) and Cluster of Differentiation 8+ (CD8+) T cells in the lymph nodes. CD4+ and CD8+ T cells function as activation of antibody production and can kill cells directly. Immune system activation can trigger the formation of proinflammatory proteins such as interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor-α (TNF-α), IL-1β, IL-8, IL- 12, IP10, MIP1A and MCP1. Excessive production of pro-inflammatory proteins will lead to increased levels of pro-inflammatory cytokines in plasma. High levels of cytokines in plasma will cause a cytokine storm. The presence of a cytokine storm in the body indicates an uncontrolled or excessive inflammatory response. Inflammation will cause an immune response in the body to activate cytokines in producing nitric oxide (NO) so that NO concentrations increase. Stimulation of the inflammatory response and the immune system carried out by using of Lactobacillus strains probiotics. Probiotic bacteria can reduce cytokines that play a role in the formation of inflammatory cells and a decrease in the immune system through the NF-KB transcription factor pathway. Lactobacillus can induce an immune response through the tolerogenic process of dendritic cells. L. plantarum has the potential to be a therapeutic candidate in the treatment of inflammation and immune system response. Therefore, it was necessary to study the bioactivity potential of L. plantarum indigenous as an immunostimulant and anti-inflammatory. L. plantarum Su-ls29, L. plantarum Su-ls52, and L. plantarum Su-ls53 are superior probiotic bacteria native to Indonesia. These three bacteria have the characteristics of superior probiotic bacteria, including acid resistance and antimicrobial properties, as well as having antagonistic activity against pathogenic bacteria. There have been no previous studies related to the anti-inflammatory and immunostimulating activities of these three bacteria. Further research is needed to reveal the potential of L. plantarum indigenous as an immunostimulant and anti- inflammatory. In this study, the anti-inflammatory and immunostimulating activity of L. plantarum probiotic metabolites were tested against mouse macrophage cell line RAW 264.7 in vitro. Determination of the bacterial strain with the best activity was carried out based on the concentrations of the cytokines IL-6, IL-1β, NO, and TNF-α. The profiling of metabolite was carried out in this study using GC-MS and UHPLC- MS/MS. The identified extracellular metabolites will be simulated in silico with molecular docking and molecular dynamics simulations. Probiotic bacteria are very sensitive to environmental conditions and have low resistance to grow in the product. Encapsulation techniques can be used as a solution to overcome the problem of low viability of probiotic bacteria in the digestive tract. The emulsion method is encapsulation in the form of a hydrocolloid suspension containing microorganisms. This method is easier to implement and the costs required are not too large. The emulsion does not use high temperatures during its manufacture so that it can maintain the viability of the microorganisms to be encapsulated. Soy protein isolate (SPI) with various concentrations is used in the manufacture of microemulsions. The SPI concentrations used were 0.5%, 1% and 2%. The microemulsion formula was made then evaluated for the characteristics of the emulsion droplet, stability and cell kinetics. The results showed that L. plantarum Su-ls29, L. plantarum Su-ls52, and L. plantarum Su-ls53 were indigenous Indonesian bacteria that have potential as immunostimulants and are non-cytotoxic with cell viability data. Based on the results of the study, the metabolite of L. plantarum Su-ls29 had the best activity as an immunostimulant against RAW 264.7 cells compared to control RAW cells with higher NO levels. The metabolite of L. plantarum Su-ls29 was identified as many as 10 metabolites that could play a role in increasing NO production. In silico prediction of 10 metabolites from L. plantarum Su-ls29 showed (8aS)-3-hydroxy-3-methyl-6,7,8,8a- tetrahydro-2H-pyrrolo[1,2-a]pyrazine- 1,4-dione had the best activity in inhibiting the pro-inflammatory proteins IL-1β and IL-6. The metabolite of L. plantarum Su-ls29- skim milk had the best anti- inflammatory activity compared to L. plantarum Su-ls29-MRSB based on LPS-induced NO production of RAW264.7 macrophage cells. The concentration of the metabolite of L. plantarum Su-ls29- skim milk 6,25 μg/mL was the best concentration for the highest NO reduction activity. L. plantarum Su-ls29-skim milk can reduce the expression of cytokine production IL-1β, IL-6, and TNF-α in RAW 264.7 cells. The best concentration values of metabolite that can reduce the production of cytokines IL-1β, IL-6, and TNF-α were 12,5 μg/mL, 25 μg/mL, and 100 μg/mL, respectively. Based on the identification of metabolites, 9 metabolites were identified in the metabolite of L. plantarum Su-ls29-skim milk and 14 metabolites were identified in L. plantarum Su- ls29-MRSB. Metabolites of 2-[carbamimidoyl(methyl)amino]acetic acid, (3R)-3- acetyloxy-4-(trimethylazaniumyl) butanoic acid, and (3R)-3-hydroxy-4- (trimethylazaniumyl)butanoic acid are thought to have a role in the activity of L. plantarum Su-ls29-skim milk as an anti-inflammatory. The probiotic bacteria L. plantarum Su-ls29 was prepared in the form of a microemulsion using various concentrations of SPI. The best characteristics of microemulsion preparations were found at 1% SPI based on scanning electron microscope data. The 1% SPI formula has an average particle size distribution of 11.1 μm. The three microemulsion formulas showed good encapsulation stability based on the pH value and viscosity during the 40 day storage.