| dc.description.abstract | Separasi sperma adalah suatu proses untuk memisahkan sperma X dan sperma
Y menggunakan metode spesifik sehingga diharapkan dapat memperoleh keturunan
sesuai dengan jenis kelamin yang diinginkan. Beberapa metode yang telah
dikembangkan untuk separasi sperma diantaranya adalah: coloumn albumin,
densitas gradien, elektroforesis, antigen H-Y, filtrasi dengan kolom Sephadex dan
flow cytometry. Metode yang memiliki akurasi 85-95% sampai saat ini adalah flow
cytometry. Aplikasi metode flow cytometry sangat mahal, memerlukan waktu lama
dan terjadinya kerusakan selama proses separasi yang menyebabkan berkurangnya
fertilitas sperma serta abnormalitas pada embrio. Metode separasi berdasarkan pada
sifat alami yang mampu memisahkan sperma X dan sperma Y dikembangkan.
Ilmuwan meyakini bahwa sperma X dan sperma Y dapat dipisahkan
berdasarkan pada perbedaan ketahanan pada media asam dan basa. pH vagina yag
cukup extrem yaitu antara 3,8-4 kemungkinan berperan penting dalam pengaturan
seleksi sperma X atau sperma Y sehingga berpengaruh terhadap jenis kelamin
keturunan yang dihasilkan. Penelitian sebelumnya melaporkan bahwa sperma Y
tidak dapat bertahan lama pada media asam, suhu tinggi, ataupun lingkungan yang
mengandung reactive oxygen species (ROS) tinggi. Pada penelitian ini dilakukan
separasi sperma berdasarkan pada hipotesis perbedaan ketahanan dan sifat
fisiologis sperma pada media yang memiliki pH asam dan basa ekstrem. Proses
separasi tersebut diharapkan dapat memisahkan sperma X dan sperma Y secara
akurat. Tujuan dari penelitian ini adalah melakukan kajian komprehenship secara
seluler dan molekuler serta fertilitas sperma hasil separasi dengan metode inkubasi
menggunakan media pH ekstrem.
Penelitian dibagi menjadi tiga tahap: (1) Karakteristik sperma pada media
dengan pH yang berbeda, (2) Kajian seluler dan molekuler sperma pada inkubasi
menggunakan media asam dan basa ekstrem, (3) Separasi sperma dan uji fertilitas
serta potensi perkembangan embrio. Pada tahap pertama, dilakukan penelitian
untuk mengevaluasi kisaran nilai pH media yang dapat ditoleransi oleh sperma dan
pengaruhnya terhadap kualitas sperma. Sejumlah 250 x 106
sperma beku Sapi
Pasundan di thawing dan dibagi menjadi 10 bagian yang sama. HCL atau NaOH
ditambahkan ke dalam media bufer untuk membuat media asam dengan pH 3,4,5,6
kontrol 7,2-7,4 dan media basa dengan pH 8,9,10,11,12. Sampel diinkubasi dalam
media dengan nilai pH yang spesifik selama 5 menit pada suhu ruang, selanjutnya
segera ditambahkan larutan bufer untuk mengembalikan ke pH 7,2-7,4. Evaluasi
dilakukan setelah 10 menit inkubasi di suhu ruang. Penelitian tahap dua, metode
thawing dan preparasi media dilakukan sesuai dengan penelitian tahap 1. Media
yang digunakan memiliki pH 4 untuk asam ekstrem, kontrol memiliki pH 7,2-7,2
dan pH 11 untuk basa ekstrem. Sperma diinkubasi di dalam media yang memiliki
pH spesifik selama 5 menit pada suhu ruang, kemudian segera ditambahkan larutan
buffer mengembalikan ke pH 7,2-7,4 dan diinkubasi selama 10 menit di suhu ruang.
Evaluasi terhadap motilitas, viabilitas, membran utuh, akrosom utuh, morfologi dan
DNA utuh pada menit ke 0, 15 dan 30 pasca 10 menit inkubasi di suhu ruang. Level
H2O2, aktivitas mitokondria, dan level Ca2+intraseluler dianalisa dengan
menggunakan confocal laser scanning microscope (CLSM). Produksi embrio in
vitro dilakukan dengan metode intracytoplasmic sperm injection (ICSI)
menggunakan sperma yang diinkubasi pada media pH 4 dan pH 11 dibandingkan
dengan kontrol. qPCR dilakukan untuk menganalisa ekspresi gen PLP, ZFY, BAX
dan PLC ζ pada sperma dan PLP, ZFY dan GLUT 3 pada embrio hasil fertilisasi
dengan metode ICSI menggunakan sperma hasil separasi.
Hasil menunjukkan menunjukkan bahwa kisaran nilai pH yang masih dapat
ditoleransi (motilitas lebih dari 10%) oleh sperma adalah 4-11, dengan kualitas
sperma yang mengalami penurunan seiring dengan kenaikan level keasaman dan
level alkali media inkubasi. Separasi sperma menggunakan media pH 4 dan pH 11
menyebabkan penurunan persentase motilitas, viabilitas, membran utuh, akrosom
utuh, morfologi normal, kenaikan level H2O2, menginduksi apoptosis, kenaikan
aktivitas mitokondria, kenaikan level Ca2+ dan kerusakan DNA. Sperma yang
diinkubasi pada pH 11, menunjukkan peningkatan level ekspresi gen PLC ζ.
Inkubasi sperma ke dalam media dengan pH 4 efektif mengisolasi sperma X
sedangkan media pH 11 efektif untuk mengisolasi sperma Y. Berdasarkan ekspresi
gen GLUT3, oosit yang difertilisasi dengan metode ICSI menggunakan sperma
yang diinkubasi pada pH 4 dan pH 11 memiliki kapasitas yang sama dengan
kelompok kontrol untuk berkembang ke tahap blastosis.
Perubahan pH selama inkubasi, menginduksi level H2O2 yang merupakan
salah satu jenis ROS yang bersifat menghambat motilitas dan menyebabkan
gangguan pada sintesis ATP. Peningkatan ROS yang eksesif menginduksi
terjadinya stress oksidatif sehingga merusak membran sperma, gangguan motilitas
dan terjadi kerusakan pada morfologi. Lebih lanjut terjadi induksi apoptosis oleh
aktivasi gen BAX yang menyebabkan terjadinya kerusakan pada DNA dan induksi
mitokondria untuk mensekresikan faktor-faktor pro apoptosis yang menyebabkan
kenaikan aktivitas mitokondria dan kenaikan level Ca2+ intraseluler via Catsperm
channel. Kenaikan level Ca2+ dan aktivitas mitokondria menyebabkan perubahan
pola motilitas pada sperma sehingga terjadi hiperaktivasi, kapasitasi dan reaksi
akrosom spontan pada sperma yang diinkubasi media pH 4 dan pH 11. Penurunan
tingkat pembelahan pada embrio hasil fertilisasi menggunakan sperma hasil
separasi kemungkinan disebabkan oleh terjadinya fragmentasi pada DNA sperma.
Namun demikian, embrio tersebut memiliki potensi untuk berkembang menjadi
blastosis karena telah melewati tahap sel blok yang terjadi pada tahap 8-16 sel.
Separasi sperma dengan inkubasi pada media pH 4 dan pH 11 dapat diaplikasikan
untuk Teknologi Reproduksi Berbantu (TRB) melalui metode fertilisasi ICSI
karena keterbatasan persentase motilitas sperma yang diperoleh. | id |
| dc.description.abstract | Sperm separation is the process of altering the proportion of sperm obtained
with X or Y chromosomes using a specific method to determine the sex outcome of
the offspring. There have been several sperm separation methods developed. It
includes albumin columns, density gradient centrifugation, electrophoresis, H-Y
antigen, filtration with a Sephadex column, and flow cytometry. Flow cytometry is
the only method with an accuracy 85%-95%. This flow cytometry technique is
reasonably expensive, takes a long time, and damages the separated sperm, which
causes a decrease in sperm fertility and abnormalities in the fertilized embryo.
Therefore, there is still a need to develop recognized techniques for a successful
natural strategy for sorting X- and Y-chromosome-bearing sperm.
Scientists believed X and Y sperm could be selected based on different
migration rates in acidic and basic media. The vagina has a moderately acidic pH
that ranges from 3.8 to 4, which may play a role in the selection of X- or Y-bearing
sperm and thus affect the sex of the offspring. Furthermore, the previous research
reported that Y sperm could not survive long in acidic media, high temperatures, or
environments with a high reactive oxygen species (ROS) content. Our study
employed to perform sperm sexing based on the hypothetical existence of
physiological differences between X- and Y-bearing sperm in extreme pH media,
as well as the idea that these differences are significant enough to allow sperm
separation. This research aims to provide comprehensive information on cellular
and molecular changes affecting sperm separation by incubating extreme pH media
and the fertilizing of the selected sperm.
The study was divided into three steps: (1) Sperm characteristics in different
pH media (2) Sperm cellular and molecular investigations in incubation using
extremely acidic and alkaline medium (3) Sperm separation and sperm fertility and
embryo development potential. For the first step, we determine the range of pH
values tolerable for sperm and the effect on sperm quality. The 250 x 106
sperm/ml
frozen-thawed Pasundan Cattle sperm was divided into ten equal aliquots, and each
was diluted in the medium within a particular pH value. HCL or NaOH was added
to buffer media to create ten different solutions with varying pH values of 3, 4, 5, 6
as acidic, 7.2-7.4 as a control, and 8, 9, 10, 11, 12 as alkali. Furthermore, the
samples were incubated for 5 minutes at room temperature within a particular pH
medium before being immediately supplemented with a buffered medium to
achieve a pH of 7.2-7.4. After 10 minutes of incubation at room temperature, all of
the parameters were assessed. For the second step, we do the same procedure for
thawing and preparing the incubation media as in the first research step. The sperm
were exposed to acid (pH: 4), alkali (pH: 11), and control medium (pH: 7.2 – 7.4)
for 5 minutes, then returned to physiological media and incubated for 10 minutes at
room temperature. Later, sperm motility, sperm viability, membrane integrity,
acrosome intact, morphology, and DNA integrity were observed at 0, 15, and 30
minutes after incubation at room temperature. The level of H2O2, mitochondrial
activity, and intracellular Ca2+ was analyzed by using CLSM. The fertility of sperm
was evaluated by the ICSI method using a selected sperm exposed to pH 4 and pH
11 compared to control. In addition, the qPCR was used to analyze the mRNA
abundance of PLP, ZFY, BAX, and PLC ζ for sperm and PLP, ZFY and GLUT3
for embryos resulting from ICSI for sperm fertility.
The results showed that sperm is still tolerable in pH 4-pH 11, but the sperm
quality degrades as the acidity or alkaline level increases. The sperm separation by
incubated bovine sperm in pH 4 and pH 11 media decreases sperm motility,
viability, membrane integrity, acrosome intactness, normal morphology, induced
apoptosis, and DNA damage. Furthermore, it also impaired the mitochondrial
activity and intracellular Ca2+, which reduced sperm fertility leading to low
cleavage rate and zygote arrest. The incubation of sperm in pH 4 seems effective to
separate X-chromosome-bearing sperm, while pH 11 media seems effective in
separating Y-chromosome-bearing sperm. According to the abundance level of the
GLUT3 gene, the fertilized oocytes using selected sperm incubated in both pH 4
and pH 11 media have the same capacity to develop into blastocyst as the control
group.
H2O2, one ROS that slows motility and interferes with ATP synthesis, is
generated when pH changes arise during incubation. The excessive rise in ROS
induces oxidative stress that damages the sperm membrane, disturbance of motility,
and alters sperm morphology. Furthermore, apoptosis is carried on by the activation
of the BAX gene, which damages sperm DNA, and the stimulation of mitochondria
to release pro-apoptotic substances that enhance mitochondrial activity and raise
intracellular Ca2+ levels via the Catsperm channel. Sperm treated in pH 4 or pH 11
environments reveal hyperactivation, capacitation, and spontaneous acrosomal
responses due to alterations in sperm motility patterns due to elevated Ca2+ and
mitochondrial activity. The lower cleavage rate in embryos fertilized with separated
sperm may be due to the fragmentation of sperm DNA. The embryo, however, can
develop into a blastocyst because it has passed the cell block stage, which takes
place during the 8–16 cell stage. Due to the low percentage of sperm motility
obtained, sperm separation by incubation in pH 4 and pH 11 medium can be used
in assisted reproductive technology (ART) through the ICSI procedure. | id |
