Resistansi Antibiotik Golongan Beta-Laktam dan Produksi Enzim Beta-Laktamase pada Escherichia coli asal Ayam

Abstract

Salah satu masalah kesehatan masyarakat utama abad ke-21 adalah resistansi antimikroba (AMR). Masalah AMR yang sangat penting adalah terkait resistansi antibiotik pada bakteri. Escherichia coli sebagai bakteri komensal pada saluran pencernaan dianggap sebagai reservoir dan pentransmisi resistansi antibiotik. Banyak penelitian resistansi antibiotik pada E. coli telah dilakukan. Penelitian terkait resistansi ampisilin pada E. coli dari berbagai hewan menujukkan angka yang tinggi. Namun, baru sedikit sekali penelitian di Indonesia yang meneliti resistansi sefalosporin pada E. coli asal hewan di Indonesia, terutama asal ayam. Kondisi resistansi seringkali dikaitkan dengan gen yang menyandikan sifat resistansi. Beberapa penelitian di Indonesia telah mendeteksi gen-gen panyandi resistansi antibiotik beta-laktam. Gen-gen penyandi resistansi yang telah dideteksi pada E. coli pada penelitian di luar negeri adalah blaTEM, blaSHV, dan blaCTX-M. Namun, penelitian deteksi ketiga gen tersebut pada isolat E. coli asal ayam di Indonesia belum pernah dilakukan. Tujuan umum penelitian ini adalah mendeteksi resistansi beta-laktam dan melihat aktivitas enzim beta-laktamase yang diproduksi dari E. coli yang berasal dari ayam. Escherichia coli pada penelitian ini berasal dari tiga lokasi berbeda yaitu Sukabumi (25 isolat), Bogor (17 isolat), dan Cianjur (10 isolat). Tiga rangkaian penelitian dilakukan dalam penelitian ini. Penelitian pertama tentang profil resistansi antibiotik pada E. coli. Penelitian pertama bertujuan untuk (1) membandingkan profil resistansi ampisilin tahun 2019 dan 2021 pada isolat E. coli yang sama dan (2) mengetahui profil resistansi ampisilin, setazidim, dan sefotaksim pada E. coli yang berasal dari ayam. Metode yang digunakan untuk uji resistansi antibiotik adalah uji difusi cakram metode Kirby-Bauer pada agar Mueller-Hinton. Uji dilakukan dengan tiga kali pengulangan. Isolat terlebih dahulu direidentifikasi dengan uj-uji identifikasi bakteri secara konvensional meliputi kultur pada agar MacConkey, kultur pada agar eosin-methylene blue, pewarnaan Gram, uji pada agar triple surag iron, uji indol, uji motilitas, uji methyl red, uji Voges-Proskauer, uji sitrat, dan uji urease. Selanjutnya dikonfirmasi dengan pomerase chain reaction (PCR) untuk mendeteksi gen uspA. Kelima puluh dua isolat terkonfirmasi E. coli dan positif gen uspA. Hasil uji resistansi ampisilin pada E. coli sangat tinggi karena seluruh isolat menunjukkan diameter zona hambat 0 mm. Hasil ini sama dengan pengujian resistansi tahun 2019 yang juga memiliki diameter zona hambat uji ampisilin 0 mm. Escherichia coli pada penelitian ini menunjukkan resistansi sefotaksim lebih tinggi daripada seftazidim. Tingkat resistansi tersebut teramati pada ketiga lokasi peternakan. Penelitian kedua adalah terkait gen peyandi resistansi yang ada pada isolat resistan. Isolat yang digunakan pada rangkaian penelitian kedua adalah sebanyak 33 isolat. Isolat tersebut minimal telah resistan dua antibiotik pada rangkaian penelitian sebelumnya (resistan ampisilin + seftazidim + sefotaksim atau ampisilin + seftazidim atau ampisilin + sefotaksim). Penelitian ini bertujuan untuk (1) mendeteksi gen blaTEM, blaSHV, dan blaCTX-M pada isolat E. coli asal ayam yang resistan ampisilin dan seftazidim dan/atau sefotaksim, serta (2) melihat kekerabatan gen blaTEM. Gen-gen penyandi resistansi dideteksi dengan metode PCR. Gen-gen target dalam penelitian ini adalah blaTEM, blaSHV, dan blaCTX-M. Gen blaTEM mendominasi perolehan deteksi gen. Seluruh isolat memiliki gen blaTEM, diikuti oleh lebih dari 50% isolat memiliki gen blaSHV, dan jumlah terendah adalah gen blaCTXM. Kombinasi blaTEM + blaSHV menjadi kombinasi dominan. Gen blaTEM sebagai gen yang paling dominan disekuensing. Lima sampel gen blaTEM dari tiga lokasi disekuensing menggunakan teknologi sanger dideoxy sequencing, dianalisis filogenetik dengan metode neighbour-joining, dan diestimasi perbedaan evolusi nukleotidanya. Kelima sampel gen blaTEM dari tiga lokasi menujukkan perbedaan nukleotida sangat rendah sehingga dapat dikatakan sama tetapi tidak memiliki kekerabatan dekat dengan semua gen yang diujikan. Penelitian ketiga adalah terkait enzim-beta laktaamse. penelitian ini bertujuan untuk (1) melakukan produksi enzim beta-laktamase pada E. coli resistan antibiotik beta-laktam kelas penisilin dan sefalosporin serta (2) melihat aktivitas biologis enzim beta-laktamase. Escherichia coli yang digunakan adalah telah resistan ampisilin, seftazidim, dan sefotaksim melalui metode Kirby-Bauer yang dimodifikasi. E. coli yang resistan antibiotik beta-laktam (ampisilin, seftazidim, dan sefotaksim). Enzim diproduksi pada media brain heart infusion (BHI) broth. Antibiotik penisilin (3 gram/liter) ditambahkan pada media BHI broth pada jam ke-6 inkubasi. Uji iodometrik digunakan untuk melihat keberadaan enzim beta-laktamase. Konsentrasi enzim kasar diukur dengan metode Lowry. Estimasi pita protein dilihat dengan SDS-PAGE. Aktivitas biologis enzim beta-laktamase dilihat dengan modifikasi metode difusi Kirby-bauer. Bakteri yang digunakan untuk uji adalah E. coli (45 dan L) dan S. aureus (TMC dan L). Protein enzim beta-laktamase kasar yang diamati adalah dari ekstraseluler dan intraseluler. Konsentrasi protein enzim kasar ekstraseluler dan intraseluler masing-masing adalah 0,35 mg/ml dan 0,44 mg/ml. Pita protein yang terbentuk lebih dari satu karena produksi enzim adalah produksi enzim kasar. Estimasi pita protein enzim tampak pada agar SDS-PAGE (antara 100 hingga 150 kDa). Enzim beta-laktamase terlihat aktivitasnya pada E. coli dan S. aureus (p<0,05). Berdasarkan rangkaian penelitian yang telah dilakukan maka dapat disipulkan beberapa hal. Escherichia coli memiliki sifat resistan terhadap antibiotik adalah terhadap ampisilin, seftazidim, dan sefotaksim. Pada E. coli yang resistan dideteksi terdapat gen penyandi resistansi antibiotik yaitu blaTEM, blaSHV, dan blaCTX-M. Gen blaTEM pada penelitian ini tidak memiliki kekerabatan dekat dengan semua data dari database GenBank yang diujikan. Enzim beta-laktamase pada E. coli resistan antibiotik yang telah diujikan berhasil diproduksi dan menunjukkan aktivitas biologis.

One of the major public health problems of the 21st century is antimicrobial resistance (AMR). A very important AMR issue is related to antibiotic resistance in bacteria. Escherichia coli as a commensal bacteria in the digestive tract is considered a reservoir and transmitter of antibiotic resistance. Many studies of antibiotic resistance in E. coli have been carried out. Research on ampicillin resistance in E. coli from various animals shows high numbers. However, only very few studies in Indonesia have examined cephalosporin resistance in E. coli from animal origin in Indonesia, especially from chicken. Resistance conditions are often associated with genes that encode resistance traits. Several studies in Indonesia have detected genes encoding beta-lactam antibiotic resistance. The genes encoding resistance that have been detected in E. coli in overseas studies are blaTEM, blaSHV, and blaCTX-M. However, research on the detection of these three genes in E. coli isolates from chicken in Indonesia has never been carried out. The general objective of this study was to detect beta-lactam resistance and to observe the activity of the beta-lactamase enzyme produced from E. coli from chicken. Escherichia coli in this study came from three different locations, namely Sukabumi (25 isolates), Bogor (17 isolates), and Cianjur (10 isolates). Three series of studies were conducted in this study. The first study on the antibiotic resistance profile of E. coli. The first study aimed to (1) compare the ampicillin resistance profile in 2019 and 2021 in the same E. coli isolates and (2) determine the resistance profile of ampicillin, cetazidime, and cefotaxime in E. coli originating from chicken. The method used to test for antibiotic resistance was the Kirby-Bauer disk diffusion test on Mueller-Hinton agar. The test was carried out with three repetitions. The isolates were first re-identified by conventional bacterial identification tests including culture on MacConkey agar, culture on eosin-methylene blue, Gram stain, test on triple sugar iron agar, indole test, motility test, methyl red test, Voges-Proskauer test, citrate test, and urease test. It was further confirmed by polymerase chain reaction (PCR) to detect the uspA gene. Fifty-two isolates were confirmed to be E. coli and were positive for the uspA gene. The results of the ampicillin resistance test on E. coli were very high because all isolates showed an inhibition zone diameter of 0 mm. This result is the same as the 2019 resistance test which also has a 0 mm ampicillin test inhibition zone diameter. Escherichia coli in this study showed higher resistance to cefotaxime than ceftazidime. The level of resistance was observed at the three farm locations. The second study was related to the resistance gene coding for the resistance isolates. The isolates used in the second series of research were 33 isolates. These isolates were resistant to at least two antibiotics in the previous study series (ampicillin + ceftazidime + cefotaxime resistance or ampicillin + ceftazidime or ampicillin + cefotaxime). This study aimed to (1) detect the blaTEM, blaSHV, and blaCTX-M genes in ampicillin and ceftazidime and/or cefotaxime-resistant E. coli isolates from chickens, and (2) examine the blaTEM gene relationship. Resistance coding genes were detected by PCR method. The target genes in this study were blaTEM, blaSHV, and blaCTX-M. The blaTEM gene dominates the acquisition of gene detection. All isolates had the blaTEM gene, followed by more than 50% of the isolates having the blaSHV gene, and the lowest number was the blaCTXM gene. The combination of blaTEM + blaSHV became the dominant combination. The blaTEM gene as the most dominant gene was sequenced. Five samples of the blaTEM gene from three locations were sequenced using sanger dideoxy sequencing technology, analyzed phylogenetic by neighbor-joining method, and estimated differences in nucleotide evolution. The five blaTEM gene samples from three locations showed very low nucleotide differences so that it could be said to be the same but not closely related to all the genes tested. The third study is related to beta-lactaamse enzyme. This study aimed to (1) produce beta-lactamase enzyme in penicillin and cephalosporin class E. coli resistant to beta-lactam antibiotics and (2) observe the biological activity of beta-lactamase enzyme. The E. coli used were resistant to ampicillin, ceftazidime, and cefotaxime using the modified Kirby-Bauer method. Escherichia coli resistant to beta-lactam antibiotics (ampicillin, ceftazidime, and cefotaxime). The enzyme was produced in brain heart infusion (BHI) broth media. The antibiotic penicillin (3 grams/liter) was added to the BHI broth medium at the 6th hour of incubation. Iodometric test is used to see the presence of beta-lactamase enzyme. The crude enzyme concentration was measured by the Lowry method. Protein band estimation was seen by SDS-PAGE. The biological activity of the beta-lactamase enzyme was examined by modifying the Kirby-bauer diffusion method. The bacteria used for the test were E. coli (45 and L) and S. aureus (TMC and L). The crude beta-lactamase enzyme protein observed was from extracellular and intracellular. The extracellular and intracellular concentrations of crude enzyme protein were 0,35 mg/ml and 0,44 mg/ml, respectively. More than one protein band is formed because the production of enzyme is the production of crude enzyme. The estimated protein band of the enzyme appeared on SDS-PAGE agar (between 100 to 150 kDa). The activity of the beta-lactamase enzyme was seen on E. coli and S. aureus (p<0,05). Based on the series of research that has been done, it can be concluded several things. Escherichia coli is resistant to antibiotics such as ampicillin, ceftazidime, and cefotaxime. In resistant E. coli, it was detected that there were genes encoding antibiotic resistance, namely blaTEM, blaSHV, and blaCTX-M. The blaTEM gene in this study was not closely related to all data from the GenBank database tested. The beta-lactamase enzyme in antibiotic-resistant E. coli that has been tested has been successfully produced and shows biological activity.