Analisis Metagenomik Profil Taksonomi dan Fungsional Komunitas Mikrob di Tempe

Abstract

Tempe adalah pangan fermentasi asli Indonesia dengan kacang kedelai sebagai bahan bakunya. Tipe fermentasi yang terbuka pada produksi tempe memungkinkan komunitas mikrob dari lingkungan bersama Rhizopus spp. sebagai laru menghidrolisis senyawa-senyawa kompleks kedelai menjadi senyawa sederhana yang lebih mudah dicerna dan meningkatkan nilai nutrisinya Saat ini terdapat sekitar 80.000 produsen tempe di Indonesia dan sebagian besar dalam kategori produsen tradisional. Keragaman proses dan lingkungan kerja tersebut berkontribusi pada variasi produk akhirnya. Pengrajin tempe tradisional di kawasan Empang (EMP) dan Warung Jambu (WJB) Bogor, Jawa Barat menggunakan prosedur perebusan kedelai yang berbeda pada proses produksinya. Korelasi perbedaan prosedur tersebut terhadap profil komunitas bakteri di ekologi mikrob kedua sampel tersebut telah diteliti sebelumnya. Pengrajin tempe tradisional di desa Tempelan (DJT), kabupaten Blora, provinsi Jawa Tengah hingga saat ini masih tetap mempertahankan penggunaan daun tanaman jati sebagai bahan pembungkus dalam produksi tempe. Penelitian baik profil taksonomi maupun fungsional dari komunitas bakteri pada ekologi mikrob produk tempe bungkus daun jati hingga saat ini belum pernah dilakukan. Analisis metagenomik shotgun (shotgun metagenomic) merupakan pendekatan lain yang dapat dilakukan pada studi metagenomik dengan melakukan sekuensing keseluruhan DNA metagenom yang telah difragmentasi. Metode ini dapat memberikan informasi fungsional komunitas mikrob selain informasi profil taksonomi pada suatu ekologi mikrob. Tujuan dari penelitian ini adalah melakukan analisis metagenomik shotgun sampel dari dua pengrajin tempe tradisional di Bogor, Jawa Barat (EMP dan WJB) dan tempe bungkus daun jati dari pengrajin tempe tradisional di Blora Jawa tengah (DJT) untuk mengkarakterisasi profil taksnomi dan fungsional komunitas mikrob ketiga sampel tersebut. High-Troughput Sequencing (HTS) total DNA metagenom sampel tempe menggunakan jasa NovogeneAIT Genomics Singapore Pte Ltd. Penyaringan raw reads hasil HTS dengan kemiripan tinggi dengan urutan basa genom Rhizopus menggunakan modul Read_QC di alur kerja MetaWRAP. Raw reads bebas kontaminasi genom Rhizopus selanjutnya di analisis profil taksonomi dan fungsional menggunakan alur kerja SqueezeMeta. Profil taksonomi hasil analisis metagenomik shotgun menunjukkan Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes dan Actinobacteria merupakan filum dengan kelimpahan relatif tinggi di metagenom sampel tempe. Filum-filum tersebut juga terkarakterisasi pada penelitian metagenomik amplikon berdasarkan markah molekuler taksonomi gen 16S rRNA sebelumnya. Hasil analisis metagenomik amplikon menunjukkan bahwa Firmicutes merupakan filum dengan kelimpahan relatif tertinggi sedangkan penelitian ini menunjukkan Proteobacteria merupakan filum dengan kelimpahan tertinggi. Analisis profil taksonomi hanya berdasarkan markah gen 16S rRNA dapat menghasilkan bias dalam perhitungan kelimpahan relatif komunitas bakteri pada suatu ekologi mikrob. Terdapat spesies bakteri yang memiliki lebih dari satu salinan (copy number) gen tersebut. Pemilihan urutan basa primer yang digunakan dan protokol amplifikasi menggunakan PCR dilaporkan juga berkontribusi terjadinya bias analisis profil taksonomi. Kelimpahan filum Bacteroidetes dan Actinobacteria pada sampel DJT relatif tinggi dibandingkan dengan sampel EMP dan WJB. Tren tersebut belum pernah dilaporkan pada penelitian profil taksonomi ekologi mikrob di tempe sebelumnya. Karakteristik organoleptik produk tempe bungkus daun berbeda dengan tempe bungkus daun pisang dan plastik. Asosiasi beberapa anggota filum Actinobacteria dan Bacteroidetes khususnya dalam kontribusi terhadap sifat sensoris produk pangan fermentasi telah diteliti sebelumnya. Profil fungsional menunjukkan komunitas bakteri aktif mentranskripsi gen– gen yang berhubungan dengan fungsi transpor dan transposase. Iron complex outer membrane recepter protein (KEGG ID: K02014) merupakan protein yang relatif paling tinggi tingkat transkripsinya pada ketiga metagenom sampel tempe. Ketersediaan hayati (bioavailability) mineral seperti zat besi pada tempe dilaporkan meningkat secara signifikan. Zat besi mempunyai peran esensial dalam pertumbuhan bakteri. Iron complex outer membrane recepter protein berperan dalam proses transpor pada sebagian besar spesies di filum Proteobacteria. Transposase merupakan protein dengan tingkat ekspresi relatif tinggi yang sering dijumpai pada analisis profil fungsional metagenom dari sampel lingkungan. Transkripsi gen-gen pada grup: biosintesis cincin korin; dan sintesis akhir dan perbaikan pada lintasan biosintesis de novo B12 di metagenom sampel EMP relatif lebih tinggi dari sampel WJB dan DJT. Genus-genus dari filum Proteobacteria relatif dominan mentranskripsi gen-gen tersebut. Telaah pustaka menunjukkan bahwa kandungan vitamin B12 tempe EMP dua kali lebih tinggi dibanding tempe WJB. Vitamin B12 mempunyai peran krusial pada beberapa proses pada lintasan metabolisme baketeri. Beberapa organisme memiliki lintasan alternatif untuk proses tersebut melalui gen yang berfungsi tanpa memerlukan vitamin B12 sebagai kofaktor (B12-independent). Hasil perbandingan transkripsi gen-gen yang pada kedua lintasan tersebut menunjukkan komunitas bakteri pada metegenom sampel tempe cenderung menggunakan jalur alternatif pada lintasan metabolisme karbon serta pada biosintesis metionina dan deoksiribonuklotida. Analisis metagenomik shotgun memungkinkan untuk mendapatkan metagenome-assembled genomes (MAGs) melalui proses binning. Jumlah MAG yang dihasilkan alur kerja SqueezeMeta sebanyak 42 dengan sembilan diantaranya sebagai “high quality MAGs”, MAG dengan tingkat kelengkapan di atas 90% dan kontaminasi di bawah 10%. Hasil anotasi lebih lanjut menunjukkan 9 MAGs memiliki kluster gen biosintesis de novo B12 baik melalui jalur aerobik maupun anaerobik.