Deteksi Molekuler Zoonosis Q Fever pada Ruminansia di Jawa Timur

Abstract

Q fever merupakan salah satu penyakit zoonotik strategis di Indonesia yang keberadaannya masih diabaikan. Persebaran penyakit zoonotik Q fever mencakup hampir seluruh negara di dunia, kecuali New Zealand, Norwegia, Islandia, dan French Polynesia. Pemerintah Indonesia melalui Keputusan Menteri Pertanian Republik Indonesia (Kepmentan) no.237/KPTS/PK.400/M/3/2019 menetapkan Q fever sebagai salah satu Zoonosis Prioritas yang perlu mendapatkan prioritas baik dalam pencegahan, pengendalian maupun penanggulangannya. Penyakit ini disebabkan oleh bakteri Gram negatif Coxiella burnetii yang bersifat parasit obligat intraseluler. Bakteri ini diklasifikasikan oleh Center of Diseases Control and Prevention ke dalam kelompok agen infeksius yang berpotensi digunakan untuk senjata biologis. Data surveillance Q fever pada hewan di dunia masih terbatas dan menyebabkan distribusi penyakit ini sulit dideteksi. Kesulitan dalam deteksi dini penyakit ini terutama disebabkan oleh gejala klinis yang tidak khas bahkan sering terjadi infeksi subklinis. Maka dari itu Q fever sering diabaikan dalam diferensial diagnosa, sehingga penyakit ini tetap berada pada kelompok ternak dan menimbulkan kerugian ekonomi dalam jangka panjang. Temuan kasus Q fever di Indonesia terutama dilaporkan terdapat pada ruminansia pada rentang tahun 2006 – 2019 dengan cakupan wilayah meliputi Jakarta, Jawa Barat, Yogyakarta, Bali, dan Sumatera Utara. Keberadaan penyakit ini di Jawa Timur belum dikaji ulang sejak penelitian terakhir di tahun 1976. Jawa Timur dikenal sebagai salah satu propinsi yang memiliki kontribusi besar dalam penyediaan pangan asal hewan di Indonesia. Identifikasi dan deteksi penyakit Q fever penting untuk dilakukan, terutama sebagai upaya penyusunan langkah pengendalian terjadinya wabah di manusia. Penelitian ini dilakukan untuk mendeteksi secara molekuler keberadaan bakteri penyebab zoonosis Q fever pada ternak ruminansia di Propinsi Jawa Timur. Penelitian ini dilakukan sejak bulan September 2015 hingga September 2020 yang terdiri dari dua tahap. Tahap pertama merupakan tahapan optimasi metode imunohistokimia untuk mendeteksi keberadaan bakteri C.burnetii di Kabupaten Bogor yang pernah dinyatakan sebagai wilayah endemis penyakit Q fever. Penelitian ini mengambil sampel organ dari sapi dan domba kurban dari wilayah Kabupaten Bogor pada tahun 2015 dan 2016 yang kemudian dideteksi dengan imunohistokimia menggunakan antibodi poliklonal Rabbit anti-C.burnetii, diperoleh dari FKH IPB dan diamati perubahan gambaran histopatologinya dengan pewarnaan Haematoxyline-Eosin (HE). Tahap kedua penelitian adalah penelitian utama dengan tujuan mendeteksi secara molekuler keberadaan bakteri C.burnetii pada ruminansia di Jawa Timur. Sampel penelitian tahap kedua berupa organ hati, limpa, ginjal, paru-paru, dan jantung ruminansia yang diambil dari rumah potong hewan di Surabaya, Malang, dan Madura. Sampel organ yang didapatkan dideteksi secara molekuler dengan metode nested polymerase chain reaction (nested PCR) menggunakan primer dari gen Outer Membrane Protein (OMP) dan gen 16S rRNA kemudian dikonfirmasi dengan imunohistokimia dan diamati perubahan histopatologi dengan pewarnaan HE. Bakteri C.burnetii terdeteksi positif pada organ paru-paru dan limpa sapi kurban di Kabupaten Bogor dengan metode imunohistokimia yang telah dimodifikasi dan dioptimasi. Hasil pemeriksaan imunohistokimia menunjukkan adanya imunoreaksi positif terhadap antibodi C.burnetii pada 4 dari 19 sampel (21%) sapi kurban tahun 2015 dan 3 dari 10 sampel (30%) sapi kurban tahun 2016. Perubahan gambaran histopatologi yang tampak pada sampel positif meliputi kongesti, infiltrasi sel radang, akumulasi mukus, hingga adanya fibrosis pada paru-paru. Pada organ yang positif uji imunohistokimia terhadap bakteri C.burnetii tidak didapatkan lesi patologis yang konsisten. Hal ini diduga berkaitan dengan kemampuan C.burnetii untuk menghindar dari respon imun serta kecepatan multiplikasi yang lambat sehingga tingkat kerusakan jaringan akibat infeksi bakteri ini rendah meskipun infeksinya berjalan lama. Upaya deteksi C.burnetii di wilayah Jawa Timur memberikan hasil positif pada 10 dari 80 (12.5%) sampel kambing di Malang dengan metode nested PCR menggunakan primer OMP. Hasil positif hanya terdeteksi pada kambing lokal jantan yang dipotong di Rumah Potong Hewan di Malang. Pemeriksaan lanjutan dengan nested PCR menggunakan primer 16S rRNA hanya mampu mengamplifikasi 4 sampel dari total 10 sampel positif. Analisa filogeni sekuens DNA C.burnetii hasil amplifikasi dengan primer OMP menunjukkan bahwa sekuens dari sampel-sampel positif tersebut identik satu sama lain. Sekuens DNA hasil amplifikasi gen 16S rRNA setelah dianalisa filogeni menunjukkan adanya kekerabatan tinggi dengan tiga sekuens DNA C.burnetii dari negara lain (Jepang dan Amerika Serikat) yang diambil dari National Center for Biotechnology Information (NCBI). Hasil imunohistokimia terhadap sampel positif di Malang menunjukkan adanya imunoreaksi positif pada sampel organ paru-paru, limpa, dan ginjal. Gambaran histopatologis dengan pewarnaan HE menunjukkan adanya radang granuloma pada paru-paru maupun ginjal serta pembentukan folikel sekunder dan deplesi pada limpa. Perubahan histopatologis yang terjadi ini tidak spesifik terhadap infeksi bakteri oleh C.burnetii, karena perubahan patologi yang sama juga ditemukan pada sampel organ yang negatif terhadap C.burnetii. Perubahan histopatologi yang tidak spesifik ini serupa dengan hasil yang ditemukan pada tahap penelitian sebelumnya di Kabupaten Bogor. Perubahan histopatologi yang tidak spesifik ini diduga berkaitan dengan reaksi jaringan yang muncul sebagai akibat infeksi dari bakteri C.burnetii menyerupai reaksi jaringan pada paparan antigen pada umumnya dan sulit untuk dibedakan. Temuan sampel positif C.burnetii pada kambing lokal Malang menguatkan dugaan bahwa penyakit Q fever endemis di wilayah Malang. Pemetaan distribusi penyakit Q fever pada wilayah yang lebih luas di Jawa Timur perlu dilakukan. Untuk memberikan gambaran dan pemahaman lebih baik terkait dengan penyakit Q fever di Jawa Timur maka perlu dilakukan penelitian lanjutan berupa analisa dengan metode lain, isolasi identifikasi dan karakterisasi bakteri serta cakupan jenis hewan yang diteliti. Deteksi keberadaan C.burnetii pada manusia perlu diteliti untuk mengetahui dampaknya pada manusia sebagai zoonosis potensial yang perlu diperhatikan.

Q fever is one of the strategic zoonotic diseases in Indonesia whose existence is still neglected. The distribution of the zoonotic disease Q fever covers almost all countries in the world, except New Zealand, Norway, Iceland, and French Polynesia. This disease is caused by the Gram negative bacterium C.burnetii which is an obligate intracellular parasite. This bacterium is classified by the Centers of Diseases Control and Prevention into a group of infectious agents that have the potential to be used for biological weapons. Surveillance data for Q fever in animals in the world is still limited and makes the distribution of this disease difficult to detect. The difficulty in early detection of this disease is mainly caused by the clinical symptoms that are not typical and even frequent subclinical infections. Therefore, Q fever is often ignored in differential diagnosis, so that this disease remains in livestock groups and causes economic losses in the long term. Q fever cases in Indonesia were mainly reported to be found in ruminants in the range of 2006 – 2019 with a coverage area of Jakarta, West Java, Yogyakarta, Bali, and North Sumatra. The presence of this disease in East Java has not been reviewed since the last study in 1976. East Java is known as one of the provinces that has a major contribution in providing food from animal origin in Indonesia. Identification and detection of Q fever urgently needed, especially to prepare for the occurrence of Q fever outbreaks in humans in the future. This research was conducted to detect molecularly the presence of bacteria that cause zoonotic Q fever in ruminants in East Java Province. This research was conducted from September 2015 to September 2020 which consisted of two stages. The first stage is the optimization stage of the immunohistochemical method as well as to detect the presence of C.burnetii bacteria in Bogor Regency, which was once declared as an endemic area for Q fever. This study took organ samples from sacrificial cattle and sheep at Bogor Regency in 2015 and 2016 which were then detected by immunohistochemistry using primary antibodies anti-C.burnetii (Polyclonal antibody Rabbit anti-C.burnetii, Faculty of Veterinary Medicine, IPB University) and observed histopathological changes with Haematoxyline-Eosin (HE) staining. Second stage of this research conducted in East Java with the intention of identification and detection for the presence of C.burnetii bacteria using molecular analysis. Liver, spleen, kidney, lung and heart of slaughtered ruminants taken from slaughterhouses in Surabaya, Malang, and Madura was used as the samples for this stage. Organ samples obtained were detected molecularly by nested PCR method with Outer Membrane Protein (OMP) gene and 16S rRNA gene primers, then confirmed by immunohistochemistry and observed histopathological changes with HE staining. C.burnetii was detected in the lungs and spleen of the sacrificial cattle in Bogor Regency by modified and optimized immunohistochemical methods. The results of the immunohistochemical examination showed positive immunoreaction to C.burnetii antibodies in 4 of 19 cow samples in 2015 (21%) and 3 of 10 cow samples in 2016 (30%). Histopathological changes seen in positive samples include congestion, inflammatory cell infiltration, accumulation of mucus, to the presence of fibrosis in the lungs. In organs that were positive for immunohistochemical tests against the bacteria C.burnetii, no consistent pathological lesions were found. This is thought to be related to the ability of C.burnetii to evade the immune response and the slow rate of multiplication so that the level of tissue damage following this bacterial infection is low even though the infection is long-lasting. The efforts to detect C.burnetii in East Java gave positive results in 10 of 80 (12.5%) samples of goats in Malang using the nested PCR with OMP primers. Positive results were only detected in male local goats slaughtered at the slaughterhouse in Malang. Follow-up examination with nested PCR using 16S rRNA primer was only able to amplify 4 samples out of a total of 10 positive samples. Phylogenic analysis of DNA sequences of C.burnetii amplified with OMP primers showed that the sequences of the positive samples were identical to each other. DNA sequences resulting from the amplification of the 16S rRNA gene after phylogeny analysis showed a high relationship with three DNA sequences of C.burnetii from other countries (Japan and United States) taken from National Center for Biotechnology Information (NCBI). Immunohistochemistry results of positive samples in Malang showed positive immunoreactions in lungs, spleen, and kidney. Histopathological appearance with HE staining showed granuloma inflammation in the lungs and kidneys as well as secondary follicular formation and depletion in the spleen. The histopathological changes that occur are not specific for bacterial infection by C.burnetii, because of similar pathological changes were also found in organ samples that were negative for C.burnetii. This unspesific histopatological change also found in previous stage of reseach that held in Bogor Regency. These non-specific histopathological changes are thought to be related to tissue reaction that occurs as a result of infection with C.burnetii, which resembles tissue reactions to antigen exposure in general and is difficult to distinguish. The finding of positive samples of C.burnetii in local goats from Malang confirms that Q fever is also endemic in Malang or East Java. Mapping the distribution of Q fever in a wider area needs to be done to confirm this suspicion and can better represent East Java. To give a better picture related to Q fever in East Java, it is necessary to carry out further research in the form of analysis with other methods, bacterial isolation, increasing variety of animal species coverage. Detection of the presence of C.burnetii in humans also needs to be investigated to determine its impact on humans as a zoonotic disease.