Perkembangan Embrio Partenogenetik Mencit yang Dikultur pada CHIR99021 sebagai Sumber Koloni Primer Parthenogenetic Embryonic Stem Cells (pESC)

Abstract

Parthenogenetic embryonic stem cell (pESC) merupakan sel punca (stem cell) yang berasal dari inner cell mass (ICM) embrio partenogenetik fase blastosis. Kelebihan stem cell ini dibandingkan dengan stem cell lainnya adalah sifat pluripotensi dan self renewal yang baik. Kendala kultur pESC adalah kemampuan embrio partenogenetik untuk membentuk blastosis masih rendah. Selain itu, blastosis partenogenetik yang dihasilkan memiliki kualitas yang rendah. Hal ini tentunya memengaruhi efektivitas kultur koloni primer dan cell line dari pESC. Tujuan penelitian ini melakukan produksi blastosis partenogenetik dengan penambahan CHIR99021 sebagai inhibitor glycogen synthase kinase 3 (GSK3) yang berkaitan dengan mekanisme aktivasi jalur Wnt/β-catenin. Tujuan kedua adalah membandingkan kuantitas dan kualitas blastosis partenogenetik yang dikultur pada CHIR99021 dengan konsentrasi 0 µM, 3 µM, dan 10 µM. Tujuan ketiga adalah melakukan kuantifikasi terhadap sekretom basic fibroblast growth factor (bFGF), epidermal growth factor (EGF), dan insulin like growth factor 1 (IGF1) yang dihasilkan oleh sel rat embryonic fibroblast (REF) pada pasase 3, 10, dan 16. Tujuan keempat adalah menganalisis kemampuan blastosis partenogenetik yang dihasilkan dari kultur yang menggunakan CHIR99021 sebagai sumber koloni primer pESC. Tujuan kelima adalah menganalisis kualitas dan pluripotensi koloni primer pESC mencit yang dihasilkan. Tujuan keenam adalah menganalisis kemampuan koloni pimer pESC yang dihasilkan untuk berdiferensiasi menjadi sel somatis. Mencit betina berusia 3 bulan disuperovulasi menggunakan penyuntikan pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) dan human chorionic gonadotropin (HCG). Sebagian dari mencit yang disuperovulasi dikawinkan dengan pejantan dan sisanya dibiarkan tanpa perkawinan. Oosit mencit dikoleksi 14 jam pascapenyuntikan HCG. Oosit yang dikoleksi kemudian diaktivasi menggunakan medium yang mengandung strontium klorida (SrCl2) 10 mmol/l dan sitokalasin B 5 µg/ml. Zigot partenogenetik kemudian dikelompokkan menjadi 3 berdasarkan medium kulturnya (kelompok CHIR99021 0 µM, CHIR99021 3 µM, dan CHIR99021 10 µM). Zigot hasil fertilisasi digunakan sebagai kontrol positif. Kultur dilakukan selam 4 hari. Sel REF dihasilkan dari metode kultur eksplan. Conditioned medium (CM) sel REF pasase 3, 10, dan 16 dikoleksi kemudian dilakukan enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) untuk mengukur konsentrasi bFGF, EGF, dan IGF1. Tingkat pasase sel REF dengan nilai sekretom terbaik akan digunakan sebagai feeder cell pada kultur koloni primer pESC. Blastosis kelompok kontrol, CHIR99021 0 µM, dan CHIR99021 3 µM kemudian dikultur menggunakan feeder cell REF. Kelompok CHIR99021 10 µM tidak digunakan sebagai sumber koloni primer pESC karena memiliki kualitas yang tidak berbeda nyata dibandingkan dengan kelompok CHIR99021 0 µM dan lebih rendah dari kelompok CHIR99021 3 µM. Koloni primer dikarakterisasi dengan metode pewarnaan imunositokimia menggunakan antibodi anti-Nanog, Oct4, dan SSEA1. Selain itu, karakterisasi juga dilakukan menggunakan pewarnaan terhadap alkaline phosphatase (ALP). Koloni primer didiferensiasikan dengan cara memperpanjang masa kultur tanpa menggunakan leukemia inhibitory factor (LIF). Diferensiasi dilakukan selama 14 hari. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa aktivasi partenogenesis menghasilkan zigot partenogenetik diploid yang ditandai dengan 2 pronukleus. Senyawa CHIR99021 3 µM mampu meningkatkan pembentukan blastosis partenogenetik secara nyata (p < 0,05) bila dibandingkan dengan kelompok perlakuan yang lain. Kualitas blastosis yang dihasilkan juga meningkat secara nyata (p < 0,05). Tingkat pembentukan dan kualitas blastosis partenogenetik mengalami penurunan (p < 0,05) karena peningkatan CHIR99021 menjadi 10 µM. Sekresi growth factor bFGF sel REF pasase 10 dan 16 lebih tinggi (p < 0,05) dari pasase 3. Sel REF pasase 16 mensekresi EGF paling tinggi dibandingkan pasase 3 dan 10 (p < 0,05). Konsentrasi IGF1 yang dihasilkan oleh sel REF pada semua tingkat pasase tidak berbeda nyata (p > 0,05). Kelompok CHIR99021 3 µM mampu menghasilkan nilai AR dan PR yang tidak berbeda nyata dibandingkan dengan kelompok kontrol (p > 0,05). Hasil karakterisasi menunjukkan bahwa semua kelompok perlakuan mengekspresikan Nanog, Oct4, dan SSEA1. Kelompok CHIR99021 3 µM mengekspresikan ALP paling baik. Hasil diferensiasi menunjukkan bahwa semua kelompok mampu membentuk embryoid body-like, sel-sel neuronal, dan sel-sel glia. Sel cardiomyocyte-like hanya terbentuk pada kelompok CHIR99021 3 µM. Simpulan dari penelitian dalam disertasi ini adalah penambahan CHIR99021 3 µM dalam media kultur memberikan hasil peningkatan blastocyst rate yang efisien. Penambahan CHIR99021 sebanyak 3 µM pada medium kultur mampu meningkatkan kualitas blastosis partenogenetik yang dihasilkan. Sel REF pasase 16 menghasilkan bFGF dan EGF yang cukup tinggi untuk mendukung kultur koloni primer pESC. Blastosis partenogenetik yang dikultur menggunakan CHIR99021 3 µM mampu menghasilkan koloni primer yang sama baiknya dengan blastosis fertilisasi. Koloni primer pESC yang dihasilkan mengekspresikan pluripotensi yang baik dan mampu berdiferensiasi menjadi embryoid body like, sel-sel neural, dan sel sel cardiomyocyte-like.