Morfogenetik Dinoflagellata Bentik Prorocentrum lima (Ehrenberg) F. Stein 1878 Berpotensi Toksik di Perairan Pulau Bintan, Pulau Belitung, Kepulauan Seribu, dan Kepulauan Karimunjawa

Abstract

Prorocentrum lima merupakan salah satu spesies Dinoflagellata bentik yang mampu memproduksi Okadaic Acid (OA) dan Dinophysistoxin (DTX’s), yang dapat menyebabkan Diarrhetic Shellfish Poisoning (DSP). Selain itu, P. lima juga berasosiasi dengan spesies penghasil ciguatoxin, Gambierdiscus toxicus, dan menyebabkan Ciguatera Fish Poisoning (CFP) di perairan tropis. Prorocentrum lima telah ditemukan di beberapa perairan di Indonesia, antara lain di Kepulauan Seribu dan Pulau Belitung (Widiarti 2002; Widiarti 2010; Widiarti 2011; Widiarti dan Pudjiarto 2015).

Prorocentrum lima memiliki variasi morfologi yang luas dan keanekaragaman morfotipe yang tinggi (Hoppenrath et al. 2013; Zhang et al. 2015; Chomérat et al. 2018), tapi belum ada penelitian mengenai hal tersebut dari perairan Indonesia. Identifikasi secara detail terhadap karakter morfologi khusus, terutama dengan mikroskop elektron adalah sangat diperlukan. Selain itu, untuk mendukung identifikasi morfologi, diperlukan pula identifikasi secara molekular. Hal tersebut dapat digunakan untuk menghindari kesalahan identifikasi, yang dapat menjadi fatal apabila spesies toksik di suatu perairan diidentifikasi sebagai spesies non toksik.

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk: mendeterminasi karakter morfogenetik P. lima di perairan Pulau Bintan, Pulau Belitung, Kepulauan Seribu, dan Kepulauan Karimunjawa; dan menentukan karakter dominan yang mencirikan P. lima berdasarkan karakter morfogenetik di empat lokasi perairan yang berbeda tersebut, beserta faktor lingkungan yang mempengaruhi.

Pengambilan sampel dilakukan di perairan kepulauan dengan terumbu karang, yang terletak di wilayah dalam perairan Indonesia bagian barat yaitu perairan Pulau Bintan, Pulau Belitung, Kepulauan Seribu, dan Kepulauan Karimunjawa, pada bulan April hingga September 2018. Lokasi pengambilan sampel diprioritaskan pada daerah dengan kondisi terumbu karang yang telah mengalami kerusakan, karena berpotensi untuk menyediakan tempat tumbuh baru bagi bermacam makroalga yang merupakan substrat yang disukai oleh Dinoflagellata bentik yang toksik (deSylva 1994). Keempat lokasi pengambilan sampel memiliki kondisi terumbu karang dengan status sedang - cukup baik (Estradivari et al. 2009; Yusuf 2013; Susetiono et al. 2014). Thallus makroalga diambil secara acak di daerah rataan terumbu, kemudian dimasukkan ke dalam botol plastik yang telah berisi air laut. Makroalga dan air laut dalam botol plastik kemudian diaduk menggunakan mesin vortex (1250 rpm selama 1 menit). Selanjutnya air sampel disaring melalui saringan bertingkat dengan ukuran pori 125 dan 20 m. Pengamatan karakter morfologi dilakukan terhadap ukuran dan bentuk sel menggunakan Light Microscope/LM (Leica DM 500), sedangkan ukuran dan bentuk pori, jumlah pori dan daerah periflagellar diamati menggunakan Scanning Electron Microscope/SEM (ZEISS dengan tipe EVOIMA10). Karakterisasi molekular diperoleh dengan melakukan amplifikasi terhadap gen LSU 28rDNA, meliputi tahap isolasi, ekstraksi, amplifikasi, elektroforesis, dan sekuesing. Ekstraksi dilakukan menggunakan beads dan Mini-Plant Extraction Kit, maupun freeze-thaw yang dilanjutkan dengan metode Single Cell PCR. Analisis filogenetik dan nilai jarak genetik antar populasi dianalisis menggunakan perangkat lunak MEGA. Karakter dominan yang membedakan di setiap stasiun penelitian dianalisis menggunakan Analisis Diskriminan, sedangkan hubungan dengan faktor lingkungan dianalisis menggunakan Principal Component Analysis (PCA).

Berdasarkan karakterisasi morfologi, terdapat tiga morfotipe P. lima di wilayah dalam perairan Indonesia bagian barat, yang sesuai dengan jumlah klaster berdasarkan Analisis Klaster, yaitu morfotipe 1 di Pulau Belitung yang sesuai dengan klaster pertama, morfotipe 2 di Kepulauan Seribu dan Kepulauan Karimunjawa yang sesuai dengan klaster kedua, serta morfotipe 3 di Pulau Bintan yang sesuai dengan klaster ketiga. Berdasarkan analisis molekular, P. lima di wilayah dalam perairan Indonesia bagian barat kemungkinan besar merupakan strain baru, yang terbagi menjadi dua sub clad yaitu sub clad A yang berasal dari Kepulauan Seribu dan Pulau Belitung, dan sub clad B yang berasal dari Kepulauan Karimunjawa dan Pulau Bintan. Prorocentrum lima yang berasal dari Pulau Bintan memiliki hubungan kekerabatan yang paling dekat dengan P. lima dari referensi.

Berdasarkan pengamatan terhadap karakter morfologi dan molekular P. lima di keempat lokasi penelitian, maka dapat dilihat bahwa keragaman morfotipe dan genetik dari P. lima di wilayah perairan tersebut sangat dipengaruhi oleh variasi dari faktor tipe morfogenesis pulau dan kondisi oseanografis. Karakter dominan yang mencirikan P. lima yang diperoleh dari Pulau Bintan, Pulau Belitung, Kepulauan Seribu, dan Kepulauan Karimunjawa adalah panjang sel, lebar sel, dan perbandingan panjang/lebar sel (rasio L/W). Faktor lingkungan terukur yang paling mencirikan dominansi karakter tersebut adalah nutrien, dalam hal ini nitrat dan fosfat.

Prorocentrum lima is one of the toxic benthic dinoflagellates known to produce OA and DTX’s, which causes DSP. Futhermore, P. lima also associates with ciguatoxin producing species, Gambierdiscus toxicus, and causes CFP in tropical waters. Prorocentrum lima have been observed from Indonesian waters, such as in Seribu Islands and Belitung Island (Widiarti 2002; Widiarti 2010; Widiarti 2011; Widiarti and Pudjiarto 2015). Prorocentrum lima has a wide range of morphological variability and possess morphotype diversity (Hoppenrath et al. 2013; Zhang et al. 2015; Chomérat et al. 2018), but such research has never been reported from Indonesian waters yet. Detailed identification on specific morphology characters is essential to obtained, especially using electron microscope. Furthermore, it is also necessary to conduct molecular identification in order to support the morphology. Those are needs to avoid misidentification, because it will become fatal when toxic species are identified as non toxic ones. The objectives of this study were: to determine the morphogenetic characteristics of P. lima in Bintan Island, Belitung Island, Seribu Islands, and Karimun Jawa Islands; and to define the dominant characters that distinguish the diversity of P. lima morphogenetics in four different waters, and the environmental factors influence. Research conducted by taking samples in the islands with reef areas, which are located in the western part of inner Indonesian waters, namely Bintan Island, Belitung Island, Seribu Islands, and Karimunjawa Islands. Sampling locations preference was on the coral reef areas with damage condition, because it could potentially provides newly growth surface for various macroalgae on which toxic dinoflagellates were favorably to attach (de Sylva 1994). All four locations had status of coral reef condition as moderate to fairly good (Estradivari et al. 2009; Yusuf 2013; Susetiono et al. 2014). Macroalgae's thallus were randomly harvested on the reef flat areas, and placed inside wide-mouthed plastic bottles containing ambient seawater. Plastic bottles containing macroalgae and seawater were shaken using vortex machine (1250 rpm for 1 minute). Furthermore, the samples were filtered through series of sieves with a mesh size of 125 and 20 µm. Cell shape and size were observed, using LM (Leica DM 500). Cell pores (shape, size and the number of pores) and periflagellar area were observed, using SEM (ZEISS with EVOIMA10 type). Molecular characterization was conducted by amplification on LSU 28rDNA gene, including isolation, extraction, amplification, electrophoresis, and sequencing. Extraction was conducted using beads and Mini-Plant Extraction Kit, also freeze-thaw which was continued with Single Cell PCR method. Phylogenetic analysis and genetic distance values were analyzed using MEGA software. Dominant characters which differentiate research stations were analyzed using Discriminant Analysis, and their relationship with environmental factors were analyzed by PCA. Based on morphological observation, results showed three morphotypes of P. lima, namely morphotype 1 which corresponds to Belitung Island cluster, morphotype 2 which corresponds to Seribu Islands and Karimunjawa Islands cluster, and morphotype 3 which corresponds to Bintan Island cluster. Based on molecular analysis, P. lima from this research were probably new strains and divided into two sub clads, namely sub clad A from Seribu Islands and Belitung Island, and sub clad B from Karimunjawa Islands and Bintan Island. Prorocentrum lima from Bintan Island showed closer relationship with P. lima from reference. Observation on the morphology and molecular characters of P. lima, showed that the morphotype diversity and genetic variance of P. lima at research sites were depend on the variation of island’s morphogenesis type and oceanographic condition. Dominant characters which characterized P. lima from Bintan Island, Belitung Island, Seribu Islands, and Karimunjawa Islands were cell length, cell width, and cell length/width ratio (ratio L/W). The environmental factors which mostly characterized were nutrients, whereas in this research were nitrate and phosphate.