Kajian In Silico dan In Vitro Peptida Antimikroba terhadap Performa Pertumbuhan pada Ayam Broiler dan Anak Babi

Abstract

Industri peternakan ayam broiler dan babi merupakan sektor peternakan yang strategis. Berkembangnya industri ini menyebabkan kebutuhan antibiotik imbuhan pakan meningkat. Antibiotik imbuhan pakan dibutuhkan oleh industri tersebut untuk mengurangi kerugian akibat penyakit diare dan dampak negatif lainnya. Akan tetapi, antibiotik imbuhan pakan mulai dilarang penggunaannya dikarenakan ditemukannya kasus alergi, kanker, resistensi terhadap bakteri patogen, dan dampak merugikan lainnya. Oleh karena itu, diperlukan alternatif baru yang tidak menimbulkan dampak negatif serupa. Salah satu alternatif adalah penggunaan peptida antimikroba (PAM). Peptida antimikroba merupakan peptida aktif yang memiliki aktivitas antimikroba, antifungi, dan antiviral. Keunggulan peptida antimikroba adalah peptida ini mudah didegradasi, tahan suhu tinggi, memiliki spektrum luas melawan bakteri patogen, dan tidak menimbulkan efek resistensi. Mekanisme peptida antimikroba yaitu peptida ini mengenali bakteri patogen melalui pengenalan sinyal dari dinding bakteri berupa lipopolisakarida. Bakteri yang teridentifikasi kemudian diikat oleh peptida ini dan dirusak dinding selnya dan/atau menghambat proses sintesis protein melalui pembentukan oksida reaktif. Kajian eksperimen terkait peptida antimikroba sudah mulai banyak dilakukan. Akan tetapi, penjabaran efek positifnya masih saling tumpang tindih, sehingga terjadi bias diantara penelitian. Metode pendekatan yang digunakan untuk menyelesaikan permasalahan tersebut adalah kajian in silico menggunakan analisis komponen utama dan meta-analisis. Selain itu, di dalam penelitian ini juga dilakukan sintesis peptida antimikroba asal maggot (Hermetia illucens) yaitu cecropin like-peptide 1 (CLP1). Selain itu juga, uji antikanker ekstrak akuades dan etanol maggot terhadap sel kanker leukemia (yaitu MOLT4 dan K562). Kajian in silico menggunakan data yang bersumber dari perpustakaan digital, literatur yang dipergunakan adalah jurnal yang relevan terkait topik penelitian. Kemudian, jurnal tersebut dipilih menggunakan protokol seleksi data dan dibangun model matematika yang merepresentasikan data. In vitro, cecropin asal maggot disintesis menggunakan sistem IVT (In Vitro Translation). Komplemen DNA cecropin ditumpang tindihkan pada fragmen T7-IRES-Kozak dan selanjutnya ditranslasikan menggunakan lisat sel epitelium. Produk peptida CLP1 diidentifikasi menggunakan SDS-PAGE, dot blot, dan mikroskop fluoresen. Ekstrak etanol dan akuades maggot diuji sitotoksiksitasnya pada sel MOLT4 dan K562 kemudian IC50 ditentukan menggunakan regresi linier. Temuan dari pemodelan in silico menggunakan analisis komponen utama, bahwa peptida antimikroba asal serangga yang dikelompokkan menjadi empat kelompok utama yaitu peptida α-heliks, peptida kaya sistein, polipeptida kaya glisin, dan peptida kaya prolin. Peptida kaya sistein memiliki aktivitas penghambatan terhadap tiga jenis mikroba yaitu bakteri gram-negatif, fungi, dan khamir. Peptida ini memiliki asam amino sistein yang membentuk jembatan disulfida sehingga struktur tersiernya menjadi stabil. Peptida lain seperti cecropin (α-heliks) asal maggot memiliki sifat antibakteri dan antikanker. Cecropin like-peptide 1 yang disintesis secara in vitro tidak mampu dideteksi menggunakan SDS-PAGE, dot blot, dan mikroskop fluoresen. Ekstrak akuades dan etanol maggot memiliki IC50 sebesar 123; 114; 204; dan 246 μg mL -1 masing-masing untuk akuades MOLT4, akuades K562, etanol MOLT4, dan etanol K562 secara berurutan. Kajian in silico menggunakan meta-analisis pada ayam broiler dan anak babi menghasilkan temuan sebagai berikut. Pertambahan bobot badan broiler kuadratik nyata (P<0,05) meningkat dengan level maksimum PAM sebesar 346 dan 360 mg kg -1 secara berurutan untuk fase starter dan finisher. Selain itu, populasi E. coli, koliform, dan bakteri aerobik nyata (P<0,05) turun di illeum. Performa pertumbuhan anak babi seperti pertambahan bobot badan signifikan (P<0,05) meningkat. Bobot badan anak babi pada umur 50 hari adalah 16,2 kg dengan level PAM optimalnya 212 mg kg -1 . PAM berperan dalam mengontrol ekosistem saluran cerna dan imunomodulator pada hewan inangnya. Mekanisme ini menyebabkan perbaikan saluran cerna sehingga proses penyerapan dan metabolisme nutrien berjalan optimal. Dampak makronya performa pertumbuhan ternak meningkat. Berdasarkan kajian in silico dan in vitro peptida antimikroba memiliki aktivitas antibakteri dan antikanker. Cecropin dari maggot sebagai peptida antimikroba diduga memiliki aktivitas antikanker. Nilai IC50 terbaik adalah ekstrak akuades sebesar 123 dan 114 μg mL -1 masing-masing pada sel leukimia MOLT4 dan K562 secara berurutan. Peptida antimikroba konsisten meningkatkan pertambahan bobot badan dan menurunkan konversi pakan pada ayam broiler dan anak babi. Level optimal peptida antimikroba pada ayam broiler adalah 337 dan 359 mg kg -1 masing-masing pada fase starter dan finisher secara berurutan. Level optimal untuk anak babi yaitu, 213 dan 221 mg kg -1 masing-masing pada fase 1 dan 2 secara berurutan. Level tersebut adalah level rekomendasi peptida antimikroba berdasarkan konversi pakan.

The broiler and swine industry is a strategic livestock sector. The development of this industry causes the used of antibiotic growth promoters (AGP) to increase. The industry needs AGPs to minimize losses due to diarrhea disease. However, AGPs have begun to be banned due to allergies, cancer, resistance to pathogenic bacteria, and other adverse effects. Therefore, we need new alternatives that do not have the same negative impact. An alternative is the use of antimicrobial peptides (AMP). Antimicrobial peptides are active peptides that have antimicrobial, anti-fungal, and antiviral activities. The advantages of AMPs are resistance to high temperatures, easily degraded, have a broad spectrum, and do not cause resistance effects. Antimicrobial peptides can recognize pathogenic bacteria using signals from the bacteria cell wall (lipopolysaccharides or LPS). Then, AMP causes damage to the bacteria cell wall or inhibits the protein synthesis. Also, lysis of bacteria due to reactive oxygen promote by AMP. The abundance of experimental studies related to antimicrobial peptides provides metadata. However, the descriptions of the positive effects still overlap, appearing in bias between studies. The approach method used to solve these problems is an in silico studies using principal component analysis and meta- analysis. This research also synthesis AMP from maggot (Hermetia illucens), namely cecropin like-peptide 1 (CLP1). Moreover, the anticancer test of water and ethanol extract against leukemia cancer cells (particularly MOLT4 and K562). The in silico study uses data sourced from digital libraries, the relevant journals related to research topics. The journals are selected using a data selection protocol then a mathematical model was built following the pattern of these data. In vitro, cecropin from maggots was synthesized using the IVT (In Vitro Translation) system. The complement DNA cecropin was overlapped on the T7-IRES-Kozak fragment and was subsequently translated using epithelial cell lysates. CLP1 was identified using SDS-PAGE, dot blot, and fluorocene microscope. The cytotoxicity of ethanol and water extracts of maggot were tested then IC50 was determined using linear regression. The findings from in silico modeling using principal component analysis were as follows. AMP from insects classifies into four main groups, such as α-helical peptides, cysteine-rich peptides, glycine-rich polypeptides, and proline-rich peptides. Cysteine-rich peptides have inhibitory activity against three types of microbes, i.e., gram-negative bacteria, fungi, and yeasts. This peptide has the amino acid cysteine which forms a disulfide bridge so that its tertiary structure becomes stable. Other peptides such as cecropin (α-helix) from maggot have antibacterial and anticancer properties. Cecropin like-peptide 1 synthesized in vitro could not be detected using SDS-PAGE, dot blot, and fluorocene microscope. Water and ethanol of the maggot extracts had IC50s of 123; 114; 294;and 246 μg mL -1 sequentially for MOLT4 ethanol, K562 ethanol, MOLT4 water, and K562 water. In silico study using meta-analysis on broiler chickens and piglets produced the following findings. Broiler body weight gain significantly (P<0,05) increased with a maximum AMP level of 346 and 360 mg kg -1 , respectively for the starter and finisher phases. Also, populations of E. coli, coliform, and aerobic bacteria are significantly (P<0,05) descended in the ileum. The growth performance of piglets, e.g., bodyweight gain significantly (P<0,05) increased. The body weight of piglets at 50 days is 16,2 kg with an optimal AMP level of 212 mg kg -1 . AMP important role in controlling the digestive tract ecosystem and immunomodulators in the host animal. This mechanism causes gastrointestinal repair so that the absorption and metabolism of nutrients run optimally. The macro impact on the performance of livestock growth is increasing. Based on in silico and in vitro studies, antimicrobial peptides have antibacterial and anticancer activity. Synthesis of the cecropin from maggot can not identify using SDS-PAGE, dot blot, and fluorocene microscope. The best IC50 was water extract with fellow value 123 and 114 μg mL -1 in MOLT4 and K562 leukemia cells, respectively. Antimicrobial peptides consistently increase body weight gain and decrease feed conversion in broiler chickens and piglets. The optimal levels of antimicrobial peptides in broiler chickens were 337 and 359 mg kg -1 in the starter and finisher phases, respectively. The optimal levels for piglets were 213 and 221 mg kg -1 in phases 1 and 2, respectively. This level is the recommended level for the antimicrobial peptide-based on feed conversion.