Identifikasi penggulung daun tanaman pisang Erionota thrax (Lepidoptera: Hesperiidae) berdasarkan DNA barcoding dan morfologi

Abstract

Tanaman pisang adalah salah satu tanaman budidaya yang menunjukkan adanya interaksi antara tumbuhan dengan serangga, diantaranya dengan penggulung daun tanaman pisang larva Erionota thrax (Lepidoptera: Hesperiidae). Distribusi penggulung daun tanaman pisang ini di Asia Tenggara, termasuk Indonesia. Erionota thrax memiliki beberapa subspesies yang masing-masing didefinisikan berdasarkan karakter morfologi fase imago, karena pada fase larva menunjukkan adanya kesamaan. Ciri spesies E. thrax belum dideskripsi secara lengkap sehingga sering ditemukan kesulitan pada saat proses identifikasi spesies ini. Identifikasi Erionota dapat dilakukan dengan mempelajari ciri morfologi yang meliputi genitalia dan pola sayap, serta melalui pendekatan molekuler DNA barcoding. Oleh karena itu penelitian ini bertujuan mengidentifikasi E. thrax berdasarkan sekuen gen mitokondrial DNA Cytochrome c Oxidase I (COI) pada larva dan karakter morfologi unik pada imago, serta mengeksplorasi variasi genetik pada diversitas haplotipe dan nukleotida populasi E. thrax di Indonesia. Koleksi sampel penggulung daun tanaman pisang dilakukan di sepuluh lokasi pada lima pulau utama di Indonesia, yaitu: Sumatera (Bangka, Metro, Lampung Timur), Jawa (Serang, Cibinong-Bogor, Bantul), Kalimantan (Sambas), Sulawesi (Gorontalo, Palu) dan Papua (Sorong). Identifikasi morfologi dilakukan pada sampel imago penggulung daun tanaman pisang berdasarkan genitalia dan karakter pola sayap yaitu dua spot kuning pada sel diskal. Tahap identifikasi melalui DNA barcoding meliputi Ekstraksi DNA, amplifikasi dan sequencing gen COI. Tahap analisis bioinformatik meliputi Basic Local Alignment Search Tool-Nucleotide (BLAST-N) di NCBI (www.ncbi.nml.nih.gov), analisis jarak genetik dan konstruksi pohon filogeni. Penelitian ini berhasil mendapatkan sekuen DNA gen COI dengan ukuran 630 pb dari empat puluh individu larva penggulung daun tanaman pisang. Konstruksi pohon filogeni empat puluh sekuen DNA larva penggulung daun tanaman pisang hasil penelitian ini dilakukan bersama dengan tiga sekuen DNA dari GenBank yaitu gen COI E. thrax, Erionota sp., dan Suastus gremius. Hasil rekonstruksi pohon filogeni juga menunjukkan adanya pengelompokan larva penggulung daun tanaman pisang berdasarkan lokasi populasi menjadi dua klade yaitu populasi Sundaland (Sumatera, Jawa, Kalimantan, dan Papua), dan populasi Sulawesi. Klade yang terbentuk didukung oleh data distribusi yang sesuai dengan wilayah distribusi Indo-Malaya dan Australasia. Hal tersebut menunjukkan bahwa gen COI dapat digunakan untuk menganalisis hubungan evolusi dan kekerabatan antara larva penggulung daun tanaman pisang di wilayah Indo-Malaya dan Australasia. Berdasarkan gen COI pada E. thrax populasi Sundaland terdapat enam haplotipe di Sumatera, Jawa, Kalimantan, dan Papua yang teridentifikasi sebagai E. thrax thrax serta satu haplotipe E. thrax populasi Sulawesi yang teridentifikasi sebagai E. thrax hasdrubal. Beberapa populasi pada subspesies E. thrax thrax memperlihatkan adanya haplotipe yang sama. Hal ini mengindikasikan adanya aliran genetik antar populasi yang tergantung pada jarak geografis, karena adanya perdagangan pisang sebagai tanaman inang E. thrax serta perpindahan materi genetik antar pulau melalui transportasi laut. Selanjutnya pada penelitian ini diperoleh informasi bahwa sampel imago penggulung daun tanaman pisang termasuk ke dalam E. thrax dengan ciri karakter genitalia jantan berupa sklerotisasi yang kuat pada cincin lateral dan lengan ventral process pada masing-masing basal lateral process. Terdapat beberapa karakter yang membedakan antara populasi Sundaland dan populasi Sulawesi. Ciri genitalia jantan E. thrax populasi Sundaland memiliki M-shape uncus yang pendek; melengkung ujung lateral process yang tumpul dan mencapai eksrimitas uncus pada dorsal dorsum; elongate dorsal ring loop yang luas; panjang valva tiga kali tingginya; ujung process valva yang secara bertahap meruncing, apikal tidak mencapai ujung harpha; bentuk phallus yang panjang, ramping dengan puncak miring. Ciri genitalia jantan E. thrax populasi Sulawesi memiliki M-shape uncus yang lebih dalam, panjang, sedikit melengkung; ujung lateral process yang runcing dan memanjang mencapai eksrimitas uncus pada dorsal dorsum; dorsal elongate ring loop yang agak sempit; panjang valva lebih dari tiga kali tingginya; ujung process valva membulat, apikal tertekan mencapai ujung harpha; bentuk phallus dengan puncak sedikit miring. Hasil analisis pengukuran spot kuning diskal pada sayap juga menunjukkan adanya perbedaan antar dua populasi tersebut, yaitu spot kuning diskal kedua pada E. thrax populasi Sundaland (E. thrax thrax) sejajar dengan spot kuning diskal pertama sebesar 50%, sedangkan pada E. thrax Sulawesi (E. thrax hasdrubal) sebesar 25%. Hasil eksplorasi dan data lokasi distribusi penggulung daun tanaman pisang E. thrax pada penelitian ini memperkaya data keanekaragaman E. thrax di Indonesia. Selain itu data molekuler sekuen DNA gen COI dan data morfologi berupa genitalia jantan dan pola sayap pada masing-masing populasi saling mendukung dalam tahap identifikasi spesies ini sebagai salah satu tahap penting dalam strategi pengendalian serangga hama terpadu.

The banana plant is one of the cultivated plants that shows the interaction between plants and insects, including the banana leaf roller larva of Erionota thrax (Lepidoptera: Hesperiidae). Distribution of banana leaf rollers in Southeast Asia, including Indonesia. Erionota thrax has several subspecies, which is defined based on the morphological character of the adult phase because the larval phase shows similarities. Characteristics of E. thrax species have not been fully described so that it is often found difficult during the identification process of this species. Erionota thrax identification can be done by studying the morphological characteristics which include genitalia and wing patterns, as well as through molecular DNA barcoding approaches. Therefore this study aims to identify E. thrax based on the mitochondrial DNA sequence of Cytochrome c Oxidase I (COI) in larva and unique morphological characters in adult and explore genetic variations in the haplotype and nucleotide diversity of E. thrax populations in Indonesia. Collection of banana leaf rollers was carried out in ten locations on five main islands in Indonesia, namely: Sumatra (Bangka, Metro, East Lampung), Java (Serang, Cibinong-Bogor, Bantul), Kalimantan (Sambas), Sulawesi (Gorontalo, Palu) and Papua (Sorong)/ Morphological identification was carried out on a sample of banana leaf roller adult based on genitalia and wing pattern characters, namely two yellow spots on discal cells. The identification stage through DNA barcoding includes DNA extraction, amplification, and sequencing of the COI gene. The bioinformatic analysis phase includes the Basic Local Alignment Search Tool-Nucleotide (BLAST-N) at NCBI (www.ncbi.nml.nih.gov), genetic distance analysis, and phylogeny tree construction. In this study we generated the sequence of 630 bp COI gene from forty individual banana leaf roller larvae. The phylogeny tree construction of forty sequences of banana leaf-rolling larva of the results of this study was carried out together with three sequences from GenBank namely the COI gene E. thrax, Erionota sp. and Suastus gremius. The results of the phylogeny tree reconstruction also showed the grouping of banana leaf roller larva based on the location of the population into two clades namely the Sundaland population (Sumatra, Java, Kalimantan, and Papua), and the Sulawesi population. The clades formed are supported by the distribution data that is suitable for the Indo-Malayan and Australasian distribution areas. This result shows that the COI gene can be used to analyze the evolutionary and relationships between banana leaf roller larvae in the Indo-Malayan region and Australasia. Based on the COI gene, E. thrax Sundaland population has six haplotypes in Sumatra, Java, Kalimantan, and Papua is E. thrax thrax and one haplotype of E. thrax Sulawesi population is E. thrax hasdrubal. Some E. thrax thrax populations show the same haplotype. This indicates the existence of genetic flow between populations that depends on geographical distance due to the trade of bananas as E. thrax host plants and the transfer of genetic material between islands via water transportation. Furthermore, in this study, information was obtained that the sample of the banana leaf roller adult was included in E. thrax with characteristic genitalia in the form of a pair of strong sclerotization in the lateral ring with the ventral process arm in each basal lateral process. Several characteristics can distinguish between Sundaland population and Sulawesi population. The male genitalia of E. thrax from Sundaland have a short M-shape uncus; the curved edge of the lateral process which is obtuse and reaches uncus extremity in the dorsal dorsum; extensive elongate dorsal ring loop; the length of the valva is three times the height; the tapered end of the valva process, apically does not reach the end of the harpha; long and slender with a sloping peak in phallus. Characteristics of male genitalia of E. thrax from Sulawesi have M-shape uncus which is deeper, longer, slightly curved; the sharp, elongated lateral process reaches uncus extremity in the dorsal dorsum; elongate dorsal ring loop rather narrow; the length of the valva is more than three times the height; rounded valva end, apically depressed end reaches harpha tip; phallus shape with a slightly tilted peak. The results of the analysis of discal yellow spot measurements on the wings also showed differences between the two populations, the second discal yellow spot on E. thrax Sundaland population (E. thrax thrax) parallel to the first discal yellow spot by 50%, while on E. thrax Sulawesi population (E. thrax hasdrubal) by 25%. The results of exploration and distribution location of E. thrax banana leaf rollers haplotype in this study are expected to be able to add the diversity data of E. thrax in Indonesia. Also, morphological data in the form of male genitalia and wing patterns, as well as COI gene sequences in each population are expected to help the identification process of this species and useful for strategy for integrated pest management.