Mempelajari faktor-faktor pembuatan zimogram protease mikroba

Abstract

Pengukuran aktivitas spesifik pada filtrat enzim yang belum murni dipengaruhi oleh keberadaan kontaminan, isozim, atau enzim-enzim lain yang segolongan sehingga tidak mewakili kondisi katalitik yang sebenarnya dari enzim subjek. Untuk menghilangkan faktor-faktor kesalahan tersebut, aktivitas enzim subjek dapat ditampakkan secara murni melalui teknik zimogram. Pada zimogram, aktivitas enzim ditampakkan secara in situ pada gel hasil elektroforesis, berupa pita yang merupakan enzim subjek. Teknik ini dapat bermanfaat untuk memperkirakan ukuran berat molekul dan konsentrasi enzim subjek yang ada. Adapun kendala penggunaan teknik ini adalah bagaimana memperoleh teknik zimogram yang tepat untuk menampilkan aktivitas enzim subjek. Dalam penelitian ini dipelajari faktor-faktor yang mempengaruhi kerberhasilan pembuatan zimogram protease mikroba, terutama dari Bacillus pumilus (YI) dan Xanthomonas campestris (axonopodis) pv. glycines (YR32). Dua macam teknik zimogram dicoba, yakni zimogram blotting film X-Ray dan zimogram kopolimerisasi substrat, dengan substrat yang dicoba adalah kasein, hemoglobin, albumin, dan gelatin. Larutan enzim B. pumilus (Y1), X. c. (a) pv. glycines (YR32), papain 0,5%, dan tripsin 2% yang diteteskan pada film X-Ray menampakkan aktivitas protease dengan lepasnya lapisan gelatin pada film. Meskipun demikian zimogram X-Ray ternyata tidak berhasil diterapkan bagi keempat cairan enzim yang disebut diatas. Zimogram ini baru memberikan hasil yang nyata pada enzim tripsin 20%. Dari hasil ini disimpulkan bahwa metode ini hanya cocok untuk protease yang memiliki konsentrasi dan/atau aktivitas yang tinggi yang hanya dapat dicapai melalui tingkat pemurnian yang tinggi. Pada zimogram kopolimerisasi substrat, kegagalan berupa penampakan aktivitas enzim berupa jalur bening atau tidak tampak aktivitas enzim karena tidak ada situs pemotongan oleh enzim. Pada sebab pertama selama elektroforesis enzim terikat oleh substrat sehingga migrasinya tidak mencapai posisi yang sebenarnya, karenanya perkiraan berat molekul tidak dapat dilakukan. Substrat kasein, hemoglobin, dan albumin, menampakkan aktivitas enzim berupa jalur bening untuk semua protease yang dicoba, kecuali protease X. c. (a.) pv. glycines (YR32) yang tidak menampakkan aktivitas enzim sama sekali pada substrat hemoglobin dan albumin. Substrat yang cocok untuk keperluan zimogram protease adalah gelatin, di mana pada kopolimerisasi gelatin 0,5% sistem SDS, protease X. c. (u) pv. glycines (YR32) menampakkan satu pita aktivitas protease yang diperkirakan memiliki berat molekul sekitar 45 kDa. Protease yang tampak ini diketahui merupakan protease serin karena terhambat oleh penambahan PMSF 1 mM. Filtrat enzim yang digunakan memiliki aktivitas sebesar 0,352 IU/ml dengan aktivitas spesifik 0,49 IU/mg. Protease B. pumilus (Y1) menampilkan 3 pita aktivitas enzim pada kopolimerisasi gelatin 0.5 % sistem non-SDS, dengan perkiraan berat molekul masing-masing sekitar 31 kDa, 27 kDa, dan 24 kDa. Ketiganya merupakan protease serin yang terhambat oleh PMSF 1 mM. Tiga pita aktivitas enzim ini tampak pada penggunaan sampel filtrat enzim yang memiliki aktivitas 0,435 IU/ml dengan aktivitas spesifik 0,64 IU/mg Pada filtrat enzim dengan aktivitas 0,210 IU/ml dan aktivitas spesifik 0,65 IU/mg hanya tampak pita yang berukuran 27 kD dan 24 kD.