Karakterisasi biokimiawi enzim protease dari bacillus subtilis DB104 rekombinan

Abstract

Melalui teknologi DNA rekombinan, dapat dilakukan kloning gen protease ke dalam mikroba lain sehingga dapat meningkatkan produktivitas dan memperbaiki sifat protease yang diekspresikan. Dalam penelitian ini dilakukan karakterisasi biokimiawi enzim protease hasil ekspresi gen protease asal Bacillus pumilus Y1 yang diisolasi dari limbah cair tahu dengan Bacillus subtilis DB104 sebagai inangnya. Enzim protease Y1 telah dikarakterisasi sifat-sifatnya dan diketahui memiliki aktivitas yang tinggi sehingga merupakan enzim yang potensial untuk dimanfaatkan secara komersial Karakterisasi yang dilakukan terhadap enzim protease B. subtilis DB104 rekombinan meliputi pengaruh suhu, pH, senyawa triton X-100, inhibitor spesifik PMSF dan EDTA, stabilitas enzim, dan pendugaan berat molekul enzim. Pengukuran konsentrasi enzim dilakukan dengan metode Bradford (1976) sedangkan untuk pengujian aktivitas proteolitiknya digunakan metode Bergmeyer et. al. (1983). Produksi protease rekombinan dilakukan dengan menginokulasikan 10% inokulum ke dalam media produksi, yaitu limbah cair tahu + skim 0,5% + CaCl₂ 5 mM, diinkubasi goyang dengan kecepatan 200 rpm pada suhu 37°C selama 10 jam. Inokulum dibuat dengan menginokulasikan 10% kultur Y1 dari media LB + kanamisin (25 µg/ml) ke dalam media yang sama dengan media produksi + kan (25 µg/ml) dan diinkubasi goyang kecepatan 200 rpm pada suhu 37°C selama 10 jam. Filtrat enzim yang diperoleh kemudian diendapkan dengan amonium sulfat 35,1% (b/v) selama semalam hingga diperoleh endapan enzim yang kemudian dilarutkan kembali dalam bufer fosfat 0,01 M pH 8 volume minimal dan ditambah CaCl₂ hingga konsentrasi akhir 2 mM. Enzim inilah yang digunakan untuk analisa. Untuk keperluan elektroforesis, sampel enzim didialisis dan dipekatkan menggunakan polietilen glikol. Suhu optimum protease rekombinan adalah 60°C dengan kisaran pH optimum 6,5 hingga 9. Dengan pemanasan pada suhu 50°C selama beberapa jam dapat menurunkan aktivitas enzim. Kestabilan enzim dapat dijaga dengan penambahan CaCl₂ 2 mM dan penyimpanan pada suhu 4°C. Adanya senyawa triton X-100 hingga konsentrasi 30% dapat mempertahankan aktivitas protease. Protease dihambat oleh PMSF yang merupakan inhibitor spesifik protease serin pada konsentrasi 1 mM dengan aktivitas tersisa 1,5%. Sedangkan oleh EDTA, aktivitas enzim tidak terlalu dihambat. Pada konsentrasi 10 mM EDTA aktivitas enzim masih sekitar 75%. Perkiraan berat molekul protease dilakukan melalui elektroforesis SDS- PAGE dan zimogram. Hasil SDS-PAGE yang memperkiran berat molekul dari sub unit enzim menunjukkan satu macam pita protein dengan berat molekul ± 29 kD. Sedangkan untuk perkiraan berat molekul enzim utuh yang dilakukan melalui zimogram menunjukkan berat molekul sekitar 59,5 kD. Dengan demikian protease utuh diperkirakan terdiri dari dua sub unit dengan berat molekul masing-masing ± 29 kD.