Karakterisasi Domain Cupredoxin Particulate Methane Monooxygenase yang Diekspresikan pada Escherichia coli BL21 (DE3) untuk Produksi Metanol dari Metana

Abstract

Metanol adalah bahan kimia yang dapat dimanfaatkan sebagai bahan baku industri kimia dan bahan bakar alternatif minyak bumi. Sekitar 60 juta ton metanol diproduksi dan jumlahnya terus meningkat tiap tahun untuk memenuhi kebutuhan industri. Metana dari gas alam adalah bahan baku utama dari produksi metanol. Gas ini dikonversi menjadi metanol melalui proses dua tahap yang membutuhkan energi yang besar (105 kcal mol-1) untuk memperoleh panas dan tekanan tinggi. Keduanya dibutuhkan untuk mengaktifkan ikatan C-H pada metana yang sangat kuat. Akibatnya, dibutuhkan biaya yang besar dan peralatan serta fasilitas tahan panas dan tekanan tinggi. Bakteri metanotrof mampu mengoksidasi metana menjadi metanol dalam suhu dan tekanan ruang dengan bantuan enzim methane monooxygenase (MMO). Protein SpmoB adalah domain cupredoxin rekombinan dari particulate methane monooxygenase (pMMO) asal bakteri Methylococcus capsulatus (Bath). Protein ini dapat mengoksidasi metana menjadi metanol pada suhu dan tekanan ruang. Protein ini diekspresikan dalam bentuk badan inklusi pada E. coli BL21 (DE3) dan belum terkarakterisasi. Penelitian ini memaparkan dan menguji pengaruh pH dan suhu pada aktivitas SpmoB, menentukan stabilitas SpmoB dalam keasaman tertentu serta kinetika reaksi dari protein SpmoB. Penelitian ini diawali dengan mengisolasi badan inklusi SpmoB dari E. coli BL21 (DE3) transforman pET15b-spmoB yang telah diinduksi dengan IPTG menggunakan teknik sonikasi untuk memecah sel dan low speed centrifugation untuk memisahkan badan inklusi SpmoB dari komponen sel lain. Badan inklusi yang didapat selanjutnya dicuci menggunakan Triton X-100 dan dilarutkan dalam denaturan berupa urea 8 M. Protein SpmoB ekstrak kasar terlarut (selanjutnya disebut protein SpmoB) direnaturasi (refolding) dengan teknik stepwise dialysis menggunakan urea 7, 6, 5,…, 0.5 dan 0 M. Sebanyak 1 mM CuSO4×5H2O ditambahkan sebagai kofaktor saat protein didialisis pada konsentrasi urea 6 M. Protein SpmoB yang didapat diukur aktivitasnya. Selanjutnya, ditentukan pH (4, 5, 6, 7, 8, 9, dan 10) dan suhu optimumnya (5 °C, suhu ruang, 30, 40, 50 dan 60 °C). Titik isoelektrik protein SpmoB ditentukan dengan membandingkan konsentrasi protein sebelum dan setelah protein SpmoB diinkubasi pada pH 4, 5, 6, 7, 8, 9, dan 10 selama 24 jam pada suhu 4 °C. Stabilitas SpmoB pada keasaman tertentu diukur dengan menginkubasi SpmoB pada tingkat keasaman yang berbeda (pH 4, 5, 6, 7, 8, 9, dan 10) selama 2 jam pada suhu ruang dan diuji aktivitasnya pada kondisi optimum serta kinetika dari protein SpmoB dalam mengoksidasi metana menjadi metanol. Metanol yang dihasilkan pada masing-masing pengujian diukur menggunakan metode spektrofotometri dengan reagen sodium nitroprusida. Protein SpmoB sebanyak 0.083 ± 0.013 mg mL-1 hasil isolasi dan refolding badan inklusi. Jumlah ini hanya 0.56% dari konsentrasi protein sel total dan 1.13% dari badan inklusi yang terisolasi. Penurunan konsentrasi yang drastis ini diakibatkan timbulnya agregat selama dialisis dan urea mendenaturasi protein SpmoB secara irreversibel selama proses solubilisasi. Protein SpmoB memiliki aktivitas sebesar 0.46 ± 0.03 μmol metanol mg-1 menit -1. Protein ini memiliki aktivitas optimum pada pH 6 dan suhu 30 °C, kedua titik optimum SpmoB ini lebih rendah dari pMMO utuh yang umumnya diukur aktivitasnya pada suhu 45 °C dan pH 7.4-7.5. Titik isoelektrik SpmoB pada pH 4 dan stabil pada pH 6, 7, dan 8. Hasil tersebut menunjukkan bahwa SpmoB adalah protein asidik. Kecepatan reaksi maksimal dari SpmoB adalah 0.380 μM metanol s-1 dan konstanta Michaelis- Menten (Km) sebesar 44.27 μM. Nilai Km tersebut lebih tinggi dari nilai Km pMMO yang berkisar antara 8.3 hingga 64 μM, sehingga dapat disimpulkan bahwa afinitas SpmoB pada metana lebih rendah dibandingkan pMMO utuh.