Karakterisasi Domain Cupredoxin Particulate Methane Monooxygenase yang Diekspresikan pada Escherichia coli BL21 (DE3) untuk Produksi Metanol dari Metana
View/ Open
Date
2019Author
Karomah, Laila
Suwanto, Antonius
Rusmana, Iman
Metadata
Show full item recordAbstract
Metanol adalah bahan kimia yang dapat dimanfaatkan sebagai bahan baku
industri kimia dan bahan bakar alternatif minyak bumi. Sekitar 60 juta ton metanol
diproduksi dan jumlahnya terus meningkat tiap tahun untuk memenuhi kebutuhan
industri. Metana dari gas alam adalah bahan baku utama dari produksi metanol. Gas
ini dikonversi menjadi metanol melalui proses dua tahap yang membutuhkan energi
yang besar (105 kcal mol-1) untuk memperoleh panas dan tekanan tinggi. Keduanya
dibutuhkan untuk mengaktifkan ikatan C-H pada metana yang sangat kuat.
Akibatnya, dibutuhkan biaya yang besar dan peralatan serta fasilitas tahan panas
dan tekanan tinggi.
Bakteri metanotrof mampu mengoksidasi metana menjadi metanol dalam
suhu dan tekanan ruang dengan bantuan enzim methane monooxygenase (MMO).
Protein SpmoB adalah domain cupredoxin rekombinan dari particulate methane
monooxygenase (pMMO) asal bakteri Methylococcus capsulatus (Bath). Protein ini
dapat mengoksidasi metana menjadi metanol pada suhu dan tekanan ruang. Protein
ini diekspresikan dalam bentuk badan inklusi pada E. coli BL21 (DE3) dan belum
terkarakterisasi. Penelitian ini memaparkan dan menguji pengaruh pH dan suhu
pada aktivitas SpmoB, menentukan stabilitas SpmoB dalam keasaman tertentu serta
kinetika reaksi dari protein SpmoB.
Penelitian ini diawali dengan mengisolasi badan inklusi SpmoB dari E. coli
BL21 (DE3) transforman pET15b-spmoB yang telah diinduksi dengan IPTG
menggunakan teknik sonikasi untuk memecah sel dan low speed centrifugation
untuk memisahkan badan inklusi SpmoB dari komponen sel lain. Badan inklusi
yang didapat selanjutnya dicuci menggunakan Triton X-100 dan dilarutkan dalam
denaturan berupa urea 8 M. Protein SpmoB ekstrak kasar terlarut (selanjutnya
disebut protein SpmoB) direnaturasi (refolding) dengan teknik stepwise dialysis
menggunakan urea 7, 6, 5,…, 0.5 dan 0 M. Sebanyak 1 mM CuSO4×5H2O
ditambahkan sebagai kofaktor saat protein didialisis pada konsentrasi urea 6 M.
Protein SpmoB yang didapat diukur aktivitasnya. Selanjutnya, ditentukan pH (4, 5,
6, 7, 8, 9, dan 10) dan suhu optimumnya (5 °C, suhu ruang, 30, 40, 50 dan 60 °C).
Titik isoelektrik protein SpmoB ditentukan dengan membandingkan konsentrasi
protein sebelum dan setelah protein SpmoB diinkubasi pada pH 4, 5, 6, 7, 8, 9, dan
10 selama 24 jam pada suhu 4 °C. Stabilitas SpmoB pada keasaman tertentu diukur
dengan menginkubasi SpmoB pada tingkat keasaman yang berbeda (pH 4, 5, 6, 7,
8, 9, dan 10) selama 2 jam pada suhu ruang dan diuji aktivitasnya pada kondisi
optimum serta kinetika dari protein SpmoB dalam mengoksidasi metana menjadi
metanol. Metanol yang dihasilkan pada masing-masing pengujian diukur
menggunakan metode spektrofotometri dengan reagen sodium nitroprusida.
Protein SpmoB sebanyak 0.083 ± 0.013 mg mL-1 hasil isolasi dan refolding
badan inklusi. Jumlah ini hanya 0.56% dari konsentrasi protein sel total dan 1.13%
dari badan inklusi yang terisolasi. Penurunan konsentrasi yang drastis ini
diakibatkan timbulnya agregat selama dialisis dan urea mendenaturasi protein
SpmoB secara irreversibel selama proses solubilisasi. Protein SpmoB memiliki
aktivitas sebesar 0.46 ± 0.03 μmol metanol mg-1 menit -1. Protein ini memiliki
aktivitas optimum pada pH 6 dan suhu 30 °C, kedua titik optimum SpmoB ini lebih
rendah dari pMMO utuh yang umumnya diukur aktivitasnya pada suhu 45 °C dan
pH 7.4-7.5. Titik isoelektrik SpmoB pada pH 4 dan stabil pada pH 6, 7, dan 8. Hasil
tersebut menunjukkan bahwa SpmoB adalah protein asidik. Kecepatan reaksi
maksimal dari SpmoB adalah 0.380 μM metanol s-1 dan konstanta Michaelis-
Menten (Km) sebesar 44.27 μM. Nilai Km tersebut lebih tinggi dari nilai Km pMMO
yang berkisar antara 8.3 hingga 64 μM, sehingga dapat disimpulkan bahwa afinitas
SpmoB pada metana lebih rendah dibandingkan pMMO utuh.