Analisis Whole Genome Klebsiella: Gen Unik Yang Berasosiasi Dengan Isolat Dari Tempe Indonesia

Abstract

Tempe merupakan pangan fermentasi kedelai tradisional yang banyak dikonsumsi oleh masyarakat Indonesia. Selama proses fermentasi, tidak hanya kapang Rhizopus spp. yang mempunyai peran sebagai inokulum, bakteri juga memainkan peranan penting dalam peningkatan pembentukan rasa dan kandungan nutrisi. Salah satu bakteri yang berperan penting dalam peningkatan nutrisi adalah Klebsiella pneumoniae, bakteri penghasil vitamin B12. Klebsiella pneumoniae selama ini tersebar di lingkungan, berasosiasi dengan tanaman dan manusia, serta dikenal sebagai isolat medis, yang menunjukkan adanya fenotip mukoid. Klebsiella pneumoniae isolat medis biasanya berasosiasi dengan manusia dan dapat menyebabkan infeksi penyakit pada manusia. Namun, Klebisella pada tempe tidak menunjukkan adanya fenotipe mukoid. Secara genetik, K. pneumoniae pada tempe berbeda grup dengan K. pneumoniae medis menggunakan analisis Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus - Polymerase Chain Reaction (ERIC-PCR). Untuk mendapatkan informasi lebih dalam tentang genetika yang mendasari perbedaan ini, dilakukan sekuensing whole genome dari isolat tempe, yaitu IIEMP-3 dan IWJB-6. Teknik bioinformatika digunakan untuk menginterpretasikan gen virulensi dan gen unik yang dapat membedakan Klebsiella pada tempe. Data whole genome Klebsiella IIEMP-3 dianotasi menggunakan software Rapid Annotation of Transfer Tool (RATT). Sementara, perakitan genom Klebsiella IWJB-6 dan proses anotasi genom menggunakan integrative bacterial genome analysis for Ion Torrent sequence data (IonGAP). Selanjutnya data whole genome divisualisasi dengan software BLAST Ring Image Generator (BRIG). Hasil visualisasi BRIG digunakan sebagai acuan untuk memilih gen unik yang dapat digunakan dalam perancangan primer untuk membedakan spesies Klebsiella pada tempe. Gen tersebut dirancang menjadi sebuah primer menggunakan primer3 (http://primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi). Pasangan primer yang didapatkan kemudian diverifikasi dengan NetPrimer (http://www.premierbiosoft.com/netprimer/) dan Primer-BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Selain primer dari gen unik, primer lain juga digunakan seperti cbiG, rmpA, dan 16S rRNA. Hasil pensejajaran menunjukkan bahwa gen virulensi, yaitu gen rmpA, tidak terdapat pada isolat IIEMP-3 dan IWJB-6. Hal ini menunjukkan bahwa Klebsiella pada tempe berbeda dengan isolat medis. Hasil tersebut diperkuat dengan visualisasi menggunakan BRIG dengan referensi K. pneumoniae subsp. pneumoniae NTUH-K2044 (GeneBank dengan nomor akses AP006725) dan K. variicola At-22 (GeneBank dengan nomor akses CP001891). Profil BRIG menunjukan bahwa magA, rmpA, irp1, dan irp2 tidak terdapat pada isolat IIEMP- 3, IWJB-6, dan K. variicola At-22. Selain itu, virB1-11 yang mengkodekan sistem sekresi tipe IV (T4SS) tidak terdapat pada isolat IIEMP-3, IWJB-6, dan K. variicola At-22. Berdasarkan hasil Polymerase Chain Reaction (PCR), semua sampel DNA dari tempe Jakarta, Bogor, Jawa Tengah, Jogjakarta, Jawa Timur, Sulawesi, Kalimantan, IIEMP-3, dan IWJB-6 tidak mempunyai gen rmpA ketika dibandingkan dengan isolat K. pneumoniae FK sebagai kontrol positif untuk isolat virulen. Hasil pensejajaran juga menunjukkan bahwa protein resisten multidrug terdapat pada isolat IIEMP-3 dan IWJB-6. Protein resistensi multidrug diduga salah satu bentuk pertahanan untuk sejumlah antibakteri yang disekresikan oleh Rhizopus spp. Selain gen virulensi, analisis bioinformatika menunjukkan bahwa gen cbiG ditemukan di semua spesies Klebsiella pada penelitian ini, yaitu K. pneumoniae subsp. pneumoniae NTUH-K2044, K. variicola At-22, Klebsiella IIEMP-3 dan IWJB-6. Semua DNA yang berasal dari tempe dan oncom mempunyai gen cbiG sama seperti pada isolat IIEMP-3 dan IWJB-6. Namun hanya tempe MWR yang tidak menunjukkan keberadaan gen cbiG. Tidak adanya gen cbiG diduga tidak adanya Klebsiella atau vitamin B12 pada tempe ini. Analisis BRIG menggunakan K. variicola At-22 sebagai referensi menunjukan bahwa gen sdsA terdapat pada K. variicola At-22, namun gen tersebut tidak ditemukan pada isolat IIEMP-3, IWJB-6, dan sembilan sampel tempe. Penelitian ini membuktikan bahwa bakteri terlibat dalam fermentasi tempe dan oncom yang dibuktikan melalui keberadaan 16S rRNA. Berdasarkan gen cbiG, salah satu bakteri yang terlibat dalam fermentasi tempe dan oncom adalah Klebsiella. Klebsiella pada tempe tidak berbahaya bagi manusia karena tidak adanya gen rmpA, yaitu gen virulensi yang dimiliki oleh K. pneumoniae isolate medis. Klebsiella pada tempe, yaitu isolat IIEMP-3 dan IWJB-6, melalui analisis bioinformatika hampir menyerupai K. variicola At-22, namun yang membedakan K. variicola At-22 dengan isolat IIEMP-3 dan IWJB-6 adalah keberadaan gen sdsA. Gen sdsA ditemukan pada sepuluh sampel tempe dan oncom, yang menunjukkan bahwa sepuluh sampel tempe dan oncom tersebut sama seperti referensi, yaitu K. variicola At-22. Namun, sembilan sampel tempe dan isolat IIEMP-3 serta IWJB-6 tidak memiliki gen sdsA, yang mengindikasikan Klebsiella pada sampel tempe ini serta isolat IIEMP-3 dan IWJB-6 adalah subspesies berbeda, dan diusulkan sebagai K. variicola subsp. tempehensis.