Peningkatan Aktivitas D-allulose 3-epimerase dari Arthrobacter psychrolactophilus menggunakan Teknik Site-Directed Mutagenesis dalam Sistem Ekspresi Escherichia coli Strain BI.21 Star DE3.

Abstract

D-allulose merupakan salah satu jenis gula langka yang semakin mendapat perhatian secara global sebagai pemanis rendah kalori, dengan keunggulan tidak memiliki after taste dan tidak menimbulkan efek laksatif pada dosis konsumsi normal seperti xylitol dan mannitol (alkohol gula), sehingga lebih aman dan nyaman digunakan sebagai alternatif gula dalam produk diet dan diabetes. Senyawa ini dapat diproduksi dari D-fruktosa melalui proses enzimatik menggunakan D- allulose 3-epimerase (DAEase). Studi sebelumnya telah berhasil memperoleh DAEase dari Arthtrobacter psychrolactophilus (ApDAEase) dan mengekspresikannya dalam sistem Escherichia coli. Meskipun ApDAEase menunjukkan stabilitas termal yang baik, peningkatan aktivitas katalitik masih diperlukan agar lebih optimal untuk aplikasi industri pangan. Penelitian ini bertujuan untuk meningkatkan aktivitas ApDAEase melalui teknik site-directed mutagenesis (SDM), dengan menargetkan residu asam amino di sekitar substrat pada sisi aktif enzim. Tujuh kandidat mutan pada mutasi spesifik ApDAEase diperkenalkan (H6D, E35H, S63D, V105A, V105D, M110D, M110H), berhasil dikonstruksi dan diekspresikan dalam sistem Escherichia coli strain BL21 Star DE3. Berdasarkan hasil analisis, konsentrasi yield protein paling rendah terdapat pada mutan E35H dan V105D yang masing-masing sebesar 4.29% dan 4.16% dan konsentrasi yield protein paling tinggi terdapat pada mutan H6D sebesar 122.44%. Hal ini menunjukkan bahwa mutasi pada residu tertentu dapat memengaruhi yield protein secara signifikan, menandakan bahwa residu ini berperan penting dalam menjaga stabilitas struktural dan fungsi enzim. Mutasi pada ApDAEase menunjukkan peningkatan aktivitas enzim yang signifikan, terutama pada mutan E35H, yang memiliki peningkatan aktivitas spesifik katalitik tertinggi sebesar 134,4% dibandingkan dengan enzim wild type. Peningkatan ini terjadi karena perubahan pada residu asam amino E35H dapat meningkatkan kestabilan lokal di sekitar sisi aktif enzim, sehingga mendukung interaksi yang lebih optimal dengan substrat dan meningkatkan afinitasnya. Selain itu, mutan V105A juga menunjukkan peningkatan aktivitas sebesar 109,3%. Peningkatan ini disebabkan oleh perubahan struktur enzim yang meningkatkan fleksibilitas di situs aktif, sehingga memungkinkan orientasi substrat yang lebih efektif selama proses katalisis. Analisis parameter kinetik menggunakan plot Michaelis-Menten menunjukkan bahwa mutan E35H meningkatkan efisiensi katalitik enzim melalui peningkatan rasio kcat/Km, sehingga lebih efektif dalam mengonversi substrat pada konsentrasi rendah. Di sisi lain, mutan V105A menunjukkan peningkatan aktivitas pada konsentrasi substrat tinggi, meskipun efisiensi katalitiknya menurun, yang mengindikasikan adanya perubahan kinetika enzim pada mutan tersebut. Hal ini menunjukkan bahwa karakteristik kinetik masing-masing mutan bervariasi, memberikan potensi aplikasi yang berbeda dalam berbagai kondisi reaksi. Analisis ekspresi protein dilakukan menggunakan SDS-PAGE dan Western blot. Hasil analisis mengkonfirmasi bahwa enzim hasil mutasi berhasil diekspresikan dengan berat molekul sekitar 34 kDa. Penelitian ini membuktikan bahwa site-directed mutagenesis dapat digunakan untuk meningkatkan aktivitas ApDAEase dan menjadi pendekatan yang efektif untuk mengoptimalkan aktivitasnya, serta memberikan wawasan lebih lanjut dalam desain enzim yang sistematis untuk produksi D-allulose skala industri.