Penapisan enzim endonuklease restriksi dari sejumlah isolat Vibrio sp. dan Xanthomonas campestria (Axonopodis) pv. glyycines

Abstract

Enzim endonuklease restriksi tipe II mampu memotong DNA pada sekuen yang spesifik, sehingga enzim ini memiliki peranan yang sangat penting dalam perkembangan bioteknologi. Enzim ini dihasilkan oleh berbagai macam bakteri yang tersebar luas di alam. Isolat-isolat bakteri asal Indonesia, yaitu isolat bakteri Vibrio sp. dan Xanthomonas campestris (axonopodis) pv. glycines, diteliti potensinya dalam menghasilkan enzim endonuklease restriksi. Penelitian ini bertujuan untuk menapis keberadaan enzim endonuklease restriksi tipe II sekaligus memanfaatkan kekayaan plasma nuftah Indonesia. Vibrio sp. ditumbuhkan pada LB yang dibubuhi 3% NaCl, pH7,5-8,0 secara aerobik (200 rpm), 28°C, 24 jam. Sedangkan Xanthomonas ditumbuhkan pada media LB (pH 7,2), dengan 10% kultur inokulum (125-150 rpm, 28°C, 1 hari), secara aerobik (125-150 rpm), 28°C, 2 hari. Sel bakteri diperoleh melalui sentrifugasi (3000 rpm, 4°C, 30 menit) yang selanjutnya disuspensikan kembali dalam buffer sonikasi (10 mM Tris-HCl pH 7,5; 1 mM EDTA; 7 mM B-merkaptoetanol) dengan perbandingan 2 g sel: 1 ml buffer. Suspensi bakteri disonikasi secara diskontinu (30 detik, istirahat 2-3 menit, 5 kali ulangan). Kotoran sel dihilangkan dengan sentrifugasi pada kecepatan tinggi (13.500 rpm, 4°C, 20 menit). Pemurnian enzim restriksi dilakukan dalam tabung mikro steril berisi 225 µl akuabides steril, 25 µl NaCl 2 M, 500 µl contoh supernatan dan 250 µl polimer konsentrat (PEG6000-dekstran T500). Tabung divorteks secara diskontinu, lalu disentrifus kembali (10.000 rpm, 4°C, 10 menit). Uji aktivitas enzim dilakukan dalam tabung mikro steril. Total volume campuran reaksi 20 µl, yang terdiri dari sejumlah DNA fage à atau plasmid, 2 µl buffer reaksi 10x (1xbuffer: 10 mM Tris-HCl pH 7,5; 7 mM MgCl2; 7 mm β- merkaptoetanol), 10 µl supernatan enzim restriksi dan air bebas ion. Campuran reaksi diinkubasi pada 37°C dengan selang waktu tertentu. Aktivitas dihentikan dengan menambahkan blue juice, lalu hasil digesti diamati dengan elektroforesis gel agarosa. Kontrol negatif yaitu DNA utuh yang mengalami perlakuan fisik yang sama, dan kontrol positif yaitu DNA yang dipotong dengan enzim restriksi komersial, dilakukan untuk membantu melihat keberhasilan suatu reaksi

digesti. Pengulangan pengendapan asam nukleat dan perpanjangan waktu digesti tidak selalu memberikan hasil uji aktivitas yang lebih baik. Isolat-isolat Vibrio sp. yang diteliti berpotensi memiliki enzim restriksi, namun dari hasil penelitian ini belum dapat disimpulkan bahwa enzim restriksi yang dimiliki bersifat spesifik. Dari penelitian ini, 15 isolat Xanthomonas campestris (axonopodis) pv. glycines yang diteliti berpotensi menghasilkan enzim restriksi dan 10 isolat, yaitu X1FL, YR29, YR32, YR34, YR37, YR48, YR60, YR61, YR64 dan YR75, berpotensi memiliki enzim restriksi tipe II. Enzim restriksi dari X1FL diduga merupakan isochizomer dari enzim Xbal.