Produksi dan karakterisasi biokimiawi protease eschericia coli DH5@ rekombinan

Abstract

Xanthomonas campesimis pv glycines IFL merupakan isolat bakteri lokat penyebab penyakit bisul pada tanaman kedelai yang menghasilkan protease ekstraseluler dengan kisaran pH optimum luas dan suhu optimum yang cukup tinggi (30-70°C) Produksi dan aktivitas protease Xanthomonas dapat terhambat dengan adanya pembentukan gum xanthan Pengklonan gen protease X. campestris pv glycines IFL ke dalam E. call DH5a dengan menggunakan vektor pRK415 dimaksudkan untuk menghasilkan protease IFL. tanpa kehadiran produk lain sekaligus meningkatkan produksi dan aktivitas enzim tersebut. Penelitian ini bertujuan untuk memproduksi protease E. coli DiSa rekombinan dan melakukan karakterisasi biokimiawi protease rekombinan sekaligus membandingkannya dengan protease X. campestris pv. glycines IFL. selaku donor gen Tahap awal dari penelitian ini adalah pembuktian keberadaan gen protease pada rekombinan dengan cars mengintroduksikan kembali gen tersebut kepada X campestris mutan protease melalui proses konjugasi yang melibatkan tiga tetua (triparental mating). Introduksi gen rekombinan kepada X campestris mutan menyebahkan A campestris kembali mampu memproduksi protease dalam jumlah besar. Aktivitas spesifik (unit aktivitas'mg protein) dari protease X. campestris mutan, X. campestris (pRK415) dan X. campestris (pRK415 rekombinan) dengan waktu fermentasi 48 jam pada media LB adalah 0,045, 0,402 dan 0,051 dan pada media LCT (Limbab Cair Tatu) sebesar 0,077, 0,101 dan 0,176 Pengukuran aktivitas protease dilakukan dengan menggunakan metode Bergmeyer et al (1983) dan penentuan kadar protein dilakukan dengan metode Bradford (1976). Bakteri E. coli DHSx rekombinan yang ditumbuhkan pada media PYGB (Pepton 2%, ektrak khamir 1%, dan gliserol 3%) dengan waktu fermentasi 24 jam memberikan aktivitas protease terbesar dibandingkan bila bakteri tersebut ditumbuhkan pada media LB dan LCT skin 0.5%+ Ca 5mM Aktivitas protease yang dihasilkan pada kondisi optimum ini berkisar antara 0,032 0,042 Unit/ml. Penambahan skim pada media PYGB tidak menambah aktivitas protease yang dihasilkan Penelitian lebih lanjut untuk melihat ekspresi dari gen protease rekombinan pada E coli dilakukan dengan membandingkan karakterisasi biokimia dari enzim tersebut dengan protesse X campestris IFL. Dari hasil karakterisasi pH diketahui bahwa proscase yang dihasilkan oleh E. con DH5u rekombinan memiliki pH optimum 8.5 yang berbeda dengan při optimum dari protease X. campestris IFL yaitu 7.5. Pola penganult suhu terhadap aktivitas kedua enzim hampir sama dan dan suhu optimum keduanya adalah 60°C. Penambahan EDTA pada protease E cow DHSa rekombinan memberikan efek penghambatan yang lebih besar dengan aktivitas sisa 26.145% pada penambahan 5 mM sedangkan aktivitas sisa protease X campestris IFL. pada penambahan yang sama adalah 55% PMSF yang merupakan inhibitor spesifik strin ternyata menghambat protease E. coli DH5a rekombinan dengan aktivitas sisa sebesar 69.47% dan 34.86% pada penambahan 1 dan 5 mM sedangkan aktivitas sisa protease X. campestris IFL pada konsentrasi yang sama adalah 75% dan 25% Hasi karakterisasi biokimiawi protease menunjukan adanya kemiripan antara protease E coù DHSa rekombinan dengan protease X. campestris IFL Dari hasil zimogram dengan menggunakan pewama Comassie Blue diketahui bahwa enzim protease yang ada pada E. coù DHS rekombinan terdiri dari dua jenis dengan berat molekul kurang lebih 49.000 dan 45.000 dalton