Kloning Gen Penyandi Lipase Termofilik dari Isolat Bakteri Asal Mata Air Panas di Pulau Seram, Maluku

Abstract

Bakteri termofilik seringkali memiliki enzim yang stabil dan aktif pada suhu tinggi yang bermanfaat untuk diaplikasikan dalam bidang bioteknologi dan industri, seperti enzim lipase yang digunakan dalam reaksi hidrolisis dan esterifikasi. Tujuan penelitian ini ialah untuk mengisolasi bakteri termofilik penghasil lipase, mengkarakterisasi lipase yang dihasilkan, dan untuk mengisolasi serta mengklon gen penyandi lipase. Isolat T I.2 adalah bakteri termofilik yang diisolasi dari sumber mata air panas yang terdapat di pulau Seram yang memiliki suhu 89°C dan pH 6,3. Isolasi dilakukan menggunakan media Basal Salt Medium dengan minyak zaitun sebagai sumber karbon untuk pertumbuhan bakteri penghasil enzim lipase. Pembandingan sekuen 16S rDNA terhadap basis data pada GenBank menggunakan Basic Local Alignment Search Tools for nucleotides (BLASTn) menunjukkan bahwa isolat T I.2 memiliki kekerabatan yang lebih dekat kepada Geobacillus stearothermophilus dengan homologi 99%. Primer yang digunakan dikonstruksi oleh Marchesi et al untuk amplifikasi gen 16S rRNA dan merupakan primer universal yang spesifik terhadap domain bakteri,. Analisis filogenetik untuk 16S rRNA dilakukan dengan menggunakan metode Neighbour Joining, dengan jarak diperkirakan menggunakan metode Kimura two parameters dengan 100 bootstrap replicates. Pohon filogenetik yang dikonstruksi menunjukkan bahwa isolat T I.2 mengelompok di antara anggota dari genus Geobacillus dan memiliki kemiripan yang lebih dekat terhadap Geobacillus stearothermophilus. Metode titrimetri digunakan untuk mengukur aktivitas lipase ekstrak kasar dari isolat T I.2 pada berbagai suhu dan pH. Hasil yang diperoleh menunjukkan aktivitas lipase optimal suhu 80°C dan pH 6,5. Prakiraan adanya gen lipase dilakukan dengan mengamplifikasi fragmen gen lipase menggunakan primer yang dikonstruksi oleh Bell et al. Primer tersebut tidak dapat mendeteksi adanya gen lipase, untuk prakiraan keberadaan gen lipase pada isolat T I.2. Isolasi gen lipase kemudian dilakukan dengan menggunakan pasangan primer yang dikonstruksi oleh Jiang et al. Primer degenerate digunakan untuk menghasilkan beberapa fragmen DNA dengan ukuran yang berbeda, dan fragmen yang berukuran kurang lebih 1200 bp digunakan sebagai template untuk amplifikasi dengan menggunakan pasangan primer F1-R1 yang dikonstruksi untuk amplifikasi gen lipase beserta sekuen signalnya, dan primer F2-R1 untuk mengamplifikasi gen lipase tanpa menyertakan signal sekuen. Pasangan primer F1-R1 hanya dapat mengamplifikasi fragmen DNA berukuran 600 bp. Gen lipase isolat T I.2 berukuran 1180 bp berhasil diamplifikasi dengan menggunakan pasangan primer F2-R1, dan diklon ke pGEM-T Easy sehingga diperoleh plasmid rekombinan pGEM-TGeolipFull dengan ukuran 4204 bp. Plasmid rekombinan kemudian ditransformasikan ke Escherichia coli TOP 10. Aktivitas enzim lipase ekstrak kasar yang dihasilkan E.coli TOP 10 transforman yang membawa plasmid rekombinan ialah sebesar 3,11 U/ml pada kondisi optimal yaitu suhu 80°C dan pH ..dst